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实时荧光定量PCR仪主要由荧光定量系统和计算机组成。荧光定量系统负责监测PCR反应过程中的荧光,而计算机则负责收集、处理和这些荧光数据。数据通过的实时软件以图表的形式显示,原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表,便于后续的和解读。
其工作原理基于在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记探针。这些荧光物质能够随着PCR反应的进行而发出荧光,其强度与扩增产物数量成正比。在PCR反应过程中,仪器通过荧光检测系统实时测量荧光强度,从而监测PCR扩增的进程。
具体来说,PCR反应包括变性、退火和延伸三个步骤。在变性步骤中,双链被打开成单链;在退火步骤中,特异性引物与模板的单链结合;在延伸步骤中,聚合酶沿着引物延伸,合成新的链。这三个步骤在PCR仪中通过准确控制温度来实现循环进行,每个循环扩增的产物量呈指数增长。
根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性,可将实时荧光定量PCR仪分为两大类:染料法和荧光探针法。
1.染料法:如SYBR Green I等荧光染料可以快速渗入双链与之结合,发射荧光,而不掺入双链的荧光染料分子不会发射任何荧光,可以对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测。这种方法可检测所有双链扩增产物,包括非特异反应产物,如引物二聚体,不需要探针,因此减少了实验设计及运转成本,适合于大量基因的,但缺点是易产生假阳性现象。
实时荧光定量PCR仪
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