固相萃取的详细操作步骤

固相萃取就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取作为样品前处理技术，在实验室中得到了越来越广泛的应用。　　1.选择SPE 小柱或滤膜　首先应根据待测物的理化性质和样品基质, 选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷, 可用阴离子交换填料, 反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物, 可用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品, 一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。　　2.活化　萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用5～ 10ml 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水　　溶性有机溶剂冲洗填料, 因为甲醇能润湿吸附剂表面, 并渗透到非极性的硅胶键合相中, 使硅胶更容易被水润湿, 之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前, 应使SPE 填料保持湿润, 如果填料干燥会降低样品保留值; 而各小柱的干燥程度不一, 则会影响回收率的重现性。　　3.上样　一般可采取以下措施: (1) 用0.1mol/L 酸或碱调节, 使pH<3或pH>9, 离心取上层液萃取；(2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液, 以水或缓冲液稀释后萃取；(3) 用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液, 调节pH 值后萃取；(4) 超声15min后加入水、缓冲液, 取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高, 加样前先用水或缓冲液稀释, 必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合, 然后萃取。流速应控制为1ml/min, 流速快不利于待测物与固定相结合。　　4.淋洗　反相SPE的清洗溶剂多为水或缓冲液, 可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节pH值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积, 而SPE滤膜为5～10ml。　　5.洗脱待测物　应选用5～10ml离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度, 则可先将洗脱液挥干后, 再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水, 可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的SPE 填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物,再用极性较强的HPLC 分析柱如C18柱分析洗脱物。若待测物可电离, 可调节pH 值, 抑制样品离子化, 以增强待测物在反相SPE 填料中的保留, 洗脱时调节pH值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱, 收集洗脱液后再调节pH值使其在HPLC分析中达到zui佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速,用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱, 回收率更高。