ACE反相系统性方法开发方案

使用ACE方法开发工具包(MDKs)进行色谱柱筛选

方法开发的四个简化步骤
• ACE MDKs包括了为互补选择性而精心设计的3支色谱柱。
• 色谱柱筛选是一种简单而又功能强大的方法, 可以快速识别最合适的色谱柱。
• 通过筛选2种不同的流动相有机改性剂可以使方法更全面。
• 以下的流程图总结了如何通过4个简单步骤执行方法开发筛选。

开始

第一步：选择流动相pH和缓冲液
根据分析物性质 (即pKa, logP和logD数据) 进行选择。对于未知分析物，使用酸性流动相作为起点。

第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色谱柱)
梯度扫描以MeOH和MeCN作为有机溶剂,进行5-95％梯度筛选。

第三步：查看数据

选择蕞佳色谱柱和有机改性剂。

第四步：方法优化

如有必要, 检查温度, pH值, 梯度斜率,梯度范围等。

是否实现分离？

是-方法开发完成

否-改变流动相条件（pH值,缓冲液等），回到第二步继续实验。

选择色谱柱和粒径尺寸。
由LC系统和用户的偏好决定。对于400 bar的HPLC系统来说, 5μm 150 x 4.6mm是个不错的选择。
对于600 bar优化的HPLC系统, 可使用2 和3μm粒径的较短色谱柱 (如100mm)。1.7μm粒径的短柱 (如50mm)适用于UHPLC系统。

如何确定合适的筛选梯度时间？
梯度时间可以使用公式1计算。
VM可用公式2计算。

tG = 梯度时间 (mins.) k* = 梯度保留系数 (通常设置约为5) ΔΦ = 梯度范围 (即对于5-95％B梯度，ΔΦ= 0.9) VM = 柱内体积 (mL) S = 5 对于小分子 (＜1000沓) F = 流速 (mL/min) L = 色谱柱长度 (mm) dc = 柱内径 (mm）

请务必记住在下一次注射前, 在梯度洗脱后以至少10倍V_M (柱内体积) 进行一次等度重新平衡。

为何使用色谱柱筛选？

• 改变色谱柱的固定相可能对选择性造成显著影响 (图1)。
• 在相同的流动相条件下, 筛选不同的色谱柱可以帮助您以更高的分辨率更快地实现所需的分离。

图1：改变色谱柱固定相的影响。
色谱柱：50x2.1mm

流动相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)

梯度：5分钟内3-100%B，
流速：0.06mL/min

温度：40°C

检测：UV，254nm

样品：1）甲硝唑，2）苄醇，3）氢氯噻嗪，4）香草醛，5）羟苯甲酯，6）1,2-二硝基苯

• ACE MDKs将具有不同相互作用机制的色谱柱组合在一起, 以最大限度地提高选择性并增加分离具有挑战性的混合物的可能性。
• 性价比高, ACE MDKs与单支色谱柱价格相同！
• 两种蕞受欢迎的ACE反相 (RP) MDK (参见下表) 包括了为利用不同的保留机制和最大化选择性而独特设计的相。
• 所有六个相都可以在反相 (RP) 条件下使用, 并且具有与C18一样的稳定性。

¹近似值– 通过半定量机制加权和/或通过参考使用>100特征分析物的其他ACE相来确定。

• 其他的ACE方法包还有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和实心核(UltraCore) 分析包
• 同样提供微孔柱尺寸 (内径0.5和1.0mm)。

成功范例
对乙酰氨基酚及有关物质