瓷珠菌种保存法

传统的菌种保存方式简介

•   斜面保存法：微生物保存基本的方法，可广泛用于细菌、真菌等，保存期限非常短，斜面容易干裂。

•   液体石蜡保存法：可用于保存霉菌、酵母菌、放线菌及需氧菌，方法简便，可防止斜面干燥和氧气进入，但一些固氮菌、分枝杆菌、毛霉、厌氧菌等不适宜用此法。

•   甘油冷冻保存法：用于一般细菌的保存，需使甘油终浓度为20%左右，然后-20℃或-70℃以下保存。融化时需要水浴溶化。

•   真空冷冻保存法：具有低温、干燥、无氧的保存条件，适用于98%以上菌种的保存，但操作复杂，一般实验室难以使用。

•   液氮保存法：基本所有微生物均可保存，并且保存时间长，但操作较为复杂而且需要设备，不适用于一般实验室保存菌种。

•   沙土保存法

•   半固体保存法

瓷珠菌种保存法的原理

瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，放置于-20℃或-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境，使菌株处于“休眠” 状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10 年）, 同时菌种保存管的取用和保存较为便利（取用复苏及保存菌种仅需1分钟）。

瓷珠菌种保存管的优点

•      用途：菌种保存、复苏和运输。

•      优点：操作简单方便、菌种保存快速、包装物体积小、菌种保存时间长。

•     操作简单方便：挑取细菌新鲜纯培养物，接入菌种保存管。

•     菌种保存快速：混匀后，吸出冷冻保存液。

•     包装物体积小：1.8ml冷冻管。

•     菌种保存时间长：2-8℃可保存6个月；-20℃可保存12个月；-80℃可保存24个月。

瓷珠菌种保存管的使用方法

菌种保存流程

1.从培养18h以上的平板上刮去新鲜纯培养物于菌种保存管中，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液。

2.拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇。

3.用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，妥善放置被吸出的液体。

4.拧紧保存管，迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。

使用时的注意事项

•   被保存的菌种要求是经过纯化后培养 18-24h 内的新鲜菌种（细菌18-24h，酵母菌需3 天，形成孢子的微生物保存孢子，而放线菌和丝状真菌需培养7 天后保存），不宜使用老化或未经鉴定的菌种。

•   菌种保存浓度必须要做3-4 麦氏比浊度，如接种浓度过低将会降低复苏效果。

•   待保存于菌种保存管中的菌种完全乳化均匀吸附在多孔小瓷珠后，要将多余的菌种保存液吸取出来并弃之，否则在复苏时的冻融过程中会损伤菌株活性。

•   做厌氧菌保存时，应提供厌氧的环境，如厌氧箱、厌氧袋，菌种保存管中可通入氮气来驱除保存菌种时所引入的氧气。菌种复苏时，也要创造厌氧的环境。

•   菌种复苏完成后，对使用菌株需要进行再次纯化，以保证菌株的单一性。

常见问题答疑

1、菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？

答：可以。对于霉菌等真菌需培养7 天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。

2、所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？

答：可以。菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存， 但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。

3、能用菌种保存管长久保存菌株吗？

答：温度越低，保藏效果越好。从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。

4、菌种保藏时为什么要进行分离纯化？

答：分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。

5、菌种保存管对于平板来说，对挑选菌落个数有要求吗？还是将整个平板的菌落全部刮入管中？

答：对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化，要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的，所以在细菌保存的过程中，为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF，是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的，如果平板长的比较满一般半个平板就够用，具体用量也根据菌种的不同有所差异，如霉菌、酵母菌在保存时，不适合用浊度法。

6、对于液体培养基培养的纯菌，是否也可以用咱们的菌种保存管？如果可以的话，怎么操作？

答：是可以用的，如果液体培养基能保证是纯菌的话，可以直接离心，弃掉上清，然后把保存管中液体吸进去充分混匀，然后再转移到菌种保存管中，整个过程要注意无菌操作。不过，一般菌种保存管选择平板菌落进行保存，因为液体培养基中有杂菌是不易观察出来的。

7、为什么在菌种保存时，要上下颠倒？为什么不能旋摇？

答：上下颠倒，可使菌悬液充分混匀，菌株充分、均匀地吸附到小瓷珠上，旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底。

8、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出？

答：吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤，加快复苏的过程，因此，要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净。而常用的甘油法，在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解，在此过程中，对菌株伤害较大。

9、在使用后，菌种保存管的保存环境？需要-80℃冰箱吗？

答：本公司菌种保存管采用的是低温冷冻保存法，因此，使用后，需放置低温环境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且温度越低，保存效果越好。用户需根据菌种的保存要求选择具体保存温度。

10、为什么说，如果有条件的话，菌种保存管置于-80 冰箱或液氮中？

答：因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。

11、为什么在取用菌株时，操作过程要求快速？

答：菌种保存复苏的原则，要求慢冻快融，之所以要求快速，是因为在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤，而我们经过改良的保存方法最很程度的避免复苏所造成的影响，但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则，保证所复苏菌种的复苏率。

12、将菌株反复冻存，到底对菌株有什么影响？

答：低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，极易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成极大损伤。

13、为什么有时候菌种的保存效果不佳？

答：1、可能是由于保存后未将保存液吸尽，反复冻融形成冰晶损伤菌株细胞，影响了菌株活性。

2、确定所保存的菌种是否为对数生长期的菌种，我们建议普通菌种保存为18小时内的新鲜菌种，而霉菌需要待孢子出现后保存其孢子。

14、该产品能否用于菌种的运送，如果可以在什么条件下运送？

答：就目前试验数据而言，我们建议可主要用于普通细菌的短期运送，对于厌氧菌在运送时让其处于厌氧环境下，2-8℃运送不超过5 天。另外需要说明的是如弧菌属和绿脓杆菌需要常温运送，其对2-8℃温度极其敏感。