肠贾第虫PCR试剂盒说明书

来源:网络  作者:网络转载   2019-10-09 阅读:959

肠贾第虫PCR试剂盒

 

中英文名称

规格

价格

说明书

Giardia intestinalis

肠贾第虫PCR试剂盒

50

1490

 

运输:低温

保存:负20

有效期:一年

货期:2-3

产品及特点

1. 即开即用,用户只需要提供肠贾第虫样品。

2. 根据肠贾第虫保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量PCR检测,避免后续污染。

5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

2×qPCR MagicMix

试剂一

500μL(棕色管)

荧光PCR专用模板稀释液

试剂二

1 mL(黄盖)

肠贾第虫PCR引物混合物

试剂三

100μL(白盖)

肠贾第虫PCR阳性对照

(1×10E8 拷贝/μL)

试剂四

50μL(红盖)

使用手册

试剂五

1

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限一年

自备试剂 

DNA模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法

、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)

1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)

10. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):

成分

样品管

N+2

PCR阴性对照管

PCR阳性

对照管(2-7管)

2×qPCR MagicMix

(棕色管)

10 μL

10 μL

各10 μL

肠贾第虫PCR

引物混合液(白盖)

2 μL

2 μL

各2 μL

自备10×ROX (见注)

2 μL

2 μL

各2 μL

 N+2待测样品DNA模板

6 μL

不加

不加

第7步所得PCR阳性对照

稀释液(2-7号)

不加

不加

各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照,其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,则用水替代。

12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

过程

温度

时间

预变性

92℃

5分钟

PCR反应

(30个循环)

92℃

60 

54℃

60 

72℃

60 

13. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时,大吸收光谱在471 nm,结合DNA时的大吸收光谱在500 nm,大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。 

四、数据处理

14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。

如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

 

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