一文轻松快速选择合适的反相色谱柱

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前言

目前市面上商品化的反相色谱柱各式各样，时常让实验人员眼花缭乱，产生幸福的烦恼，很难快速选择合适的色谱柱。通常我们会从键合相类型、键合相在硅胶表面的覆盖率、是否封端、封端类型等方面去选择反相色谱柱。本文从已表征色谱柱的参数，通过量化数值去快速选择合适的反相色谱柱。

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色谱柱表征体系

色谱柱表征体系通过量化分析色谱柱中影响溶质保留行为的特征，对色谱柱进行分类，从而指导实际工作中色谱柱的选择。有效的色谱柱表征体系应具有以下特点：

（1）考虑了对色谱柱选择性有贡献的所有因素；（2）每一个柱参数表征一种专属的溶质—色谱柱相互作用；（3）能够得到da部分商业柱的色谱柱参数；（4）对于特定色谱柱，不同实验室能够得到 可重现的色谱柱参数；（5）在特定实验条件下测定的色谱柱参数能应用到任何流动相或任何柱温下的分离。

目前国际上比较成熟的色谱柱表征体系有4个，分别是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色谱柱工作小组领导完成。其中，由Snyder等基于反相色谱保留机制提出的疏水消除模型，理论基础较坚实，对色谱柱选择性的表征较全面，与其余3个体系的柱参数本质上并无区别，均取自代表性溶质的保留值，参数测定方法简便，实现选择相似或者不同色谱柱的目的。由于USP网站公开常用色谱柱的参数，USP方法表征的色谱参数更方便我们筛选色谱柱。

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色谱柱表征参数

对于反相色谱柱选择性主要为疏水作用、立体选择性和氢键作用，还有一些二级作用，比如：离子交换、金属螯合作用等。

3.1 USP数据库

疏水作用（Hy）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行乙基苯测试，考察乙基苯的保留因子，保留因子越da，色谱柱的疏水作用越强。

立体选择性（TFA）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行阿米替林测试，考察阿米替林的拖尾因子，由于阿米替林特殊的立体结构，拖尾因子越小，色谱柱的立体选择性越强，同时硅醇基作用较弱。

金属杂质含量（CTF）：色谱柱中会残留少量的金属离子，一般金属离子会与喹啉结构发生螯合作用，导致峰拖尾，故喹啉拖尾因子越da，色谱柱金属杂质含量越da。

氢键作用（CFA）：阿米替林是碱性化合物，在酸性或中性条件下呈离子态，保留因子较小，保留主要依靠氢键作用，阿米替林保留因子越da，色谱柱氢键作用越强。

3.2 PQRI数据库

疏水作用（H）：通过同yi流流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行戊基苯和丁基苯测试，考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比，比值越da，色谱柱对不同碳链长度化合物的选择性越强，疏水作用越强。

立体选择（S）：区分平面结构（三苯乙烯）和空间体积较da 的结构（邻三苯基）的能力。前者与后者保留因子之比体现空间选择性，比值越da，立体选择越强。图示见图1。

氢键作用（A或B）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱测试咖fei因和苯酚保留因子比值，数值越da，氢键作用越强。PQRI数据库进一步将氢键能力描述为氢键酸度(A)、非电离硅烷与碱相互作用的能力和氢键碱度(B)、硅胶表面或键合相与酸性分析物的特性进一步相互作用的能力。

离子交换作用（pH2.7或7.0）：在流动相pH2.7和7.0下，分别测试苯苄胺和苯酚保留因子之比，比值越da，说明色谱柱区分极性化合物的能力越强。

固定相类型：A——A型硅胶，无定型硅胶，表面残余da 量硅醇基；B——B型硅胶，球形高纯硅胶，目前主流硅胶类型，硅醇基残留少；E——键合相含嵌入极性基团的固定相；phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相；F——氟代固定相。

对比USP与PQRI的数据信息，PQRI数据库的色谱柱参数更加全面反应色谱柱的性能。

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案例

目前色谱柱公司均推出各自方法开发的推荐色谱柱包，比如Waters公司推出经济实惠型的色谱柱包：XBridge C18，XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通过PQRI数据库检索。

从上表可知：

①疏水作用CORTECS C18+＞XBridge C18＞XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP＞XBridge Phenyl，XBridge Shield RP18的键合相含内嵌极性基团，碳载量相对低，苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳载量低，故H值较低。

②空间选择性，Xselect HSS PFP较为突出，CORTECS C18+最低，S值反应硅胶表面键合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空间选择性强。

③氢键作用，XBridge Shield RP18和苯基柱最突出，XBridge C18最低，XBridge Shield RP18内嵌的酰胺基团和苯基与酸性和碱性分析物均有强偶极作用。这两根柱子可以分离强极性化合物。

④离子交换作用，在酸性和中性条件下五氟苯基柱的离子交换能力突出，对苯环不同取代物的相似物质选择性强，CORTECS C18+柱在中性条件下离子交换作用强，其对酸性化合物增强保留，对碱性化合物有较好的峰型。

这四款反相色谱柱，各具特点，在分离不同特点的化合物时具有各自的特长，在方法开发中他们可以互补，可提高柱筛选的效率。

在实际工作中，有好多方法有指定的色谱柱，但我们在研究过程中，会找性能相似的色谱柱作为备选色谱柱。可以通过PQRI数据库查找与目标色谱柱相似的色谱柱，只要F值在3以内，均可尝试。比如方法中规定选用Nucleodur C18 Gravity，一个小众品牌的色谱柱，如果想替代之，可从数据查询与之类似的色谱柱。

从上可知：与Nucleodur C18 Gravity相似的色谱柱很多，有我们熟悉的Waters Cortecs C18、岛津Inertsil ODS-2和Kromasil C18，并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。

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小结

反相色谱柱表征体系逐渐成熟，并且广泛地用于筛选色谱柱。根据da 多待测物质性质结合色谱柱参数可快速筛选目标色谱柱。但色谱柱表征体系针对特定样品中难分离物质对的分离，还有待细化。对于结构类似待测物的分离只和部分关键色谱柱参数有关。因此，如何更好地研究难分离物质与关键色谱柱参数的关系，并针对品种在液相色谱方法中规定关键柱参数的zui佳范围，还需要研究者的不断探索。