实验试剂质粒肉汤、LBEDO肉汤根据参考文献配置；LB肉汤（LBbroth）、Mueller-Hinton（MH）琼脂、营养琼脂购自北京陆桥技术有限责任公司；琼脂糖（GIBCO）、Taq酶（Fermentas）、DNTPs（Promega）、MgCl2（Promega）、质粒提取试剂盒（RocheCat：1-754-777）购自北京三博远志生物技术有限公司；引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；氨苄青霉素、卡那霉素（sigma）购自北京三泰兴隆科技有限公司；E-test纸条（ABBIODISK）购自广州白云同和海特科技经营服务部；QIAquickPCR产物纯化试剂盒（cat.27104）购自北京华顺公司。
菌株、质粒和噬菌体实验菌株为国家食源性疾病监测网分离的一株鼠伤寒沙门菌野生株X2；标准菌株PY1、质粒pKD46、模板质粒pKD4及噬菌体P22HT105和P22H5均由美国马里兰大学馈赠。引物设计根据参考文献和Genbank利用Oligo411软件设计特异性引物，引物序列见<4>.
pKD46质粒转化pKD46质粒提取按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒。感受态细胞（标准菌株PY1）的准备从标准菌株PY1分离平板中挑取单个菌落，接种于100mlMH培养基，230rPmin，37e振荡培养。至A0.34时，在冰中冷却30min；取40ml培养液，2700@g，离心15min；用等体积预冷的去离子水轻轻地洗3遍。每次在冰盒中静置2min去除水分；加入200Ll预冷的去离子，轻轻混匀成菌悬液；吸取40Ll菌悬液，加入2Ll纯化质粒DNA，混匀后冰中垂直静置1min（使用预冷的移液头和试管）。
pKD46质粒转化通过电穿孔法转化<5>.
DNA片断合成11611PCR扩增反应分别以acrAB和tolC基因敲除引物扩增PCR产物，反应均以pKD4质粒为模板。25LlPCR反应体系包括：上下游引物（20LmolPL）各0175Ll，10@PCRbuffer215Ll，dNTPs（10mmolPLeach）015Ll，MgCl2（20mmolPl）115Ll，DNA模板1Ll，Taq酶1U，补充无菌去离子水至25Ll，混匀后加入1滴液体石蜡，以防止蒸发。扩增反应条件为：94e，10min；94e，1min；50e，1min；72e，2min；循环10次；94e，1min；60e，1min；72e，2min；72e，10min；循环25次。将扩增产物用115的琼脂糖凝胶（含015EB）进行电泳，在100V恒压下电泳45min，在紫外灯下观测结果，用凝胶成像系统拍照。
PCR扩增产物的提取和纯化将PCR扩增产物收集于115ml的离心管中，按照QIAquickPCR产物纯化试剂盒说明书进行操作。DNA片断的转化带有pKD46质粒感受态菌株的准备从标准菌株PY1（已用pKD46转导）分离平板中挑取单个菌落，接种于100ml的MH培养基（含100LgPml氨卞青霉素，10mmolPL阿拉伯糖），230rPmin，37e振荡培养。至A013014时，用冰冷却30min；取40ml培养液，2700@g，离心15min；用等体积冷去离子水轻轻地洗3遍。每次在冰盒中静置2min去除水分；加入200Ll冷去离子，轻轻混匀成菌悬液备用。
PCR产物的转化分别吸取40Ll菌悬液，加入2LlPCR产物，混匀后冰中垂直静置1min.（使用预冷的移液头和试管）；电穿孔按照Ec1程序进行（1182kV，516ms），立即将菌悬液轻轻地混悬于1mlSOC中；100rPmin，30e，振荡培养1h；将菌悬液涂布于含50LgPml卡那霉素的MH琼脂平板，100LlP平板，37e培养过夜；从含50LgPml卡那霉素的MH琼脂平板上分离3个菌落，42e培养过夜，使pKD46质粒丢失；在含50LgPml氨卞青霉素的MH琼脂平板30e培养确认质粒丢失，突变株在-80e保存。突变确认利用敲除确认引物，通过PCR确认突变，反应条件如下：95e，5min；94e，1min；52e，1min；72e，1min；72e，5min；循环35次。
突变前后耐药性的改变利用E-test耐药条对野生株X2和突变株vtolCX2和vacrABX2对15种抗生素的MIC进行了检测。结果发现突变株vtolCX2和vacrABX2对万古霉素的MIC均为256LgPml，对丁胺卡那霉素的MIC均为210LgPml，对头孢曲松的MIC均为0125LgPml，与野生株X2比较变化不大，但对另外11种抗生素的MIC明显下降；对卡那霉素的MIC均为256LgPml，而野生株X2对卡那霉素的MIC为8LgPml，是由于突变株含有卡那霉素耐药基因标记物造成的。结果见。
本研究提示AcrAB-TolC系统与万古霉素的耐药性无关，亲代野生株和突变株对万古霉素的MIC>256LgPml一样，说明其他耐药机制在发挥作用。鼠伤寒沙门菌多重耐药株存在其他的外流泵系统，目前对它们的功能还不是很清楚。已知在大肠杆菌中acrD和acrF基因也同样编码外流泵，AcrD是氨基糖甙类抗生素的外流泵<7，8>.在大肠杆菌中AcrA与AcrF或AcrD互相作用，形成功能更大的外流泵系统。基因分析表明鼠伤寒沙门菌LT2的AcrB和AcF的同源一致性达到80，与大肠杆菌的AcrB和AcrF同源一致性分别达到96和88，提示鼠伤寒沙门菌LT2的AcrB和AcrF与大肠杆菌的AcrB和AcrF可能具有相似的功能。鼠伤寒沙门菌LT2的AcrD与AcrB和AcrF的一致性分别达到64和65.在鼠伤寒沙门菌突变株中AcrA表达的增加引起AcrB、AcrF和AcrD表达的增加，在敲除acrB（或acrF）时，可增加acrF和acrD（或acrB和acrD）的表达水平<7>.另外对一些鼠伤寒沙门菌多重耐药突变株的研究发现孔蛋白OmpF的表达减少，而有的却没有变化<2>，这些均提示在鼠伤寒沙门菌可能还存在其他的与AcrAB外流泵相似的系统。
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