连续细胞循环??真空发酵生产乙醇研究

　　新工艺新设备新技术本栏目由卢氏神曲协办连续细胞循环真空发酵生产乙醇研究王泽云，朱浩里，张君，刘德华清华大学化学工程系，北京iroo84过抽真空消除了乙醇抑制，连续细胞循环真空发酵的乙醇产率达23.03吕。

　　前言近年来，方面由于我国杂交水稻技术的迅速发展，水稻产量大幅度提高，市场出现严重供过于求的局面，尤其是收稿日期2002究。

　　早籼米因食用性较差而大量积压，导致米价下跌；而另方面，随着大庆油田产油量的下降及国内因汽车数量的大幅，加汽油消耗量的日益，长，汽油价格持续升高为解决这矛盾，国家已将发展燃料乙醇列为十重点推广项目。本文以廉价的早籼米为原料，经液化糖化后，发酵生产乙醇。

　　这样不仅可以解决早籼米过剩的问，而且发酵生产的燃料乙醇可减少汽油的消耗量，从而控制油价的不断上涨。

　　7李用芳。面包酵母原生质体的制备再生及紫外诱变的初步研宄32627.

　　8王唐义，徐开成，等。产，Ml赛母的诱变育种。酿酒科技，1993，对于乙醇发酵过程，以往研宄者己就固定化酵母溶，萃，脱分离工气提和贞空发醉等方法分别做了研宄。但这些方法由于存在溶剂对酵母的毒性膜堵塞气提效率低及工业化成本的问，目前仍处于实验阶段。

　　由于提高发酵液的菌体浓度消除乙醇抑制作用，是实现高强度乙醇发酵的两个重要方面。所以，本文采用连续细胞循环真空发酵耦合工艺，通过连续细胞循环提高发酵液中而实现高强度乙醇发酵。

　　I材料和方法ii原料早籼米湖南金键米业有限公司提供。

　　糖化酶酶活5000单位化购自无锡酶制剂厂1.2菌种生物所1.3培养基1.3.1斜面培养基麦芽汁20；水10；琼脂16 1.3.2种子培养基葡萄糖5，8阳423，4，04 1.3.3发酵培养基除葡萄糖浓度不同外，其余组分同种子培养坫。以1培，基均在5，鹁，1；1.4早私米的液化和糖化早籼稻米粉加去离子水调料浆浓度3040，加入氯化钙，使钙离子浓度为，搅拌，调，=6，加入液化酶2中位米粉。加热至8892，浪化2降温至加入糖化酶100单位4米粉。似温搅拌至爪乃。

　　15实验方法与装置连续细胞循环实验的操作过程为于51发酵罐中加入1葡萄糖浓度为。的糖化液发酵培养基。火菌后怕种子液，开始发酵，每隔341取次样，测发酵液中葡萄糖浓度，当发酵液中葡萄糖浓度降至约15时，开启流加栗，按预定流量向发酵罐中加入灭菌后的培养基，同时打开出料泵，按相同流量将发酵液打入澄清器，等澄清器中液位达到定高度后，加大出料泵流量，同时开启循环栗，将澄清器底部浓缩后的菌液抽回发酵罐。当澄清器中液位达到溢流液位时，流加泵流量等于澄清器溢流量，系统达到稳定状态在整个操作过程中，需保持发酵罐中液位恒定，即使出料泵流量等于循环泵与流加泵流量之和。对于不同的流加速率，按照上述流量控制原则，相应的调整出料泵与循环栗流量，使整个系统处于平衡状态实验装置为1去掉真空与制冷部分。

　　连续细胞循环真空发酵过程实验步骤的开始部分同常压连续细胞循环发酵过程。不同的是在糖化液开始流加前12开启制冷系统，当低温浴槽温度降至1后，开启真空泵，几分钟后发酵罐中压力降至约35，1体系开始沸腾，测发酵液中葡萄糖和乙醇浓度分别降至约2，1和41之。开始流加糖化液发酵培痄基。流加过程中流加泵出料泵和循环泵流量控制与常压连续细胞循环发酵过程有所不同，因为与常压连续细胞循环发酵过程相比，连续细胞循环真空发酵耦合过程物流更复杂，即多项挥发部分，因而液位控制更复杂些控制原则为流加栗流量+循环泵流量=出料泵流量+挥发量。溢流速率和挥发速率可通过物料衡算求得。发酵结束时，首先打开放空阀，当系统压力恢复到常压后关闭真空泵。实验装置1.

　　醇浓度流加时间段的平均浓度及乙醇生产速率的关系。

　　较高，但呈下降趋势，这是因为刚开始流加时罐中本身的葡萄糖浓度比较高，而不是由于流加速率快所造成的；稀释率在0924之间时，发酵液中残糖基本保持在5，88；当稀释率升至残糖浓度开始升，说明此时稀释率超过大值，大量细胞被冲出，发酵速率下降。另外，中曲线显，稀释率对发酵液中乙醇浓度影响不大，只有在稀释率超过极限时，发酵液中的乙醇浓度开始下降。乙醇的生产速率在稀释率低于3时与稀释率呈线性关系。稀释率超过，3后，由于大量细胞被冲出，乙醇生产速率迅速下降。

　　由可，在发酵培养基开始流动前，葡萄糖和乙醇浓度的变化规律与批式发酵相同，开始流加后，葡萄糖浓度略有下降，之后基本保持在1兔1上下，乙醇浓度则基本稳定在35，4电1在连续细胞循环发酵过程中，由于随着稀释率及发酵液中细胞浓度增大，台泵的流量需要调节，在调节过程中发酵罐中液位出现波动，因而造成中细胞浓度葡萄糖和乙醇浓度的波动。

　　为了更直观的了解连续细胞循环过程稀释率，对发酵率随稀释率的变化过程。

　　来不及沉降即被溢出，发酵罐中细胞浓度开始下降。

　　始流加之前，随发酵时间延长，细胞浓度由慢到快逐渐，加；当细胞浓度上到58并且开始以1.5，1流加发酵培养基时，细胞浓度开始有所下降，之后又逐渐上升，而且增加速率随着稀释率的增加由慢到快呈递增趋势；当流加速率升至6.随稀释率的增加发薛液中胞浓度基本维持在1几上下，不再增加；当流加速率继续上升到心1；以上后，细胞浓度呈现下降趋势。分析整个细胞浓度变化过程，这是因为，开始流加时，澄清器中还没有发酵液，也没有细胞回流，因而浓度略有降低，随着澄清器中液位升高，开启循环泵，澄清器底部由于细胞沉降，菌体浓度较高的发酵液被循环回发酵罐，使发酵罐中菌体浓度开始上升，由于在刚开始循环阶段，澄清器中液位还没有达到溢流液位，澄清器阶段细胞浓度增长较慢；之后随着稀释率的增加，细胞比生长速率增加，而且澄清器已达到溢流液位，沉降效率也达到高，所以发酵罐中菌体浓度增长速率也加快；当稀释率继续增加，并且在定范围内超过澄清器的大能力时，澄清器中开始有细胞溢出，发酵罐中菌体浓度基本保持平衡；若分析方法161此值按1式汁算，1=被测液还原糖介1被测液中户物吣量2葡萄糖和乙醇含量采用高效液相色谱法测定6.样品稀释100倍，12，离心，取上清液测定。色谱柱条件流相为重蒸水，流速1就企葡萄糖和乙醇的停留时间分别为2761血和418也。

　　3菌浓度测定。样品稀释10倍，620下以清水为对照，测吸光度，对照吸光度和菌体干重标准曲线，得出菌体浓度。

　　2结果与讨论21常压连续细胞循环发酵对于连续发酵过程，流加速率是影响发酵菌体浓度和发酵速率的重要因素。本实验考察了不同流加速率对发酵过程的影响。23是常压连续细胞循环发酵实验结果发酵条件⑴然胃流加涪养基葡萄糖浓度为！I.

　　比较连续细胞循环真空发酵和常压连续细胞循环发酵结果可以看出，由于前者通过抽真空使发酵液中乙醇浓度被控制在较低的水平，克服了后者对流加培养基葡萄糖浓度的限制，从而使澄清器的负荷降低，发酵罐中菌体浓度升高，发酵速率比后者提高了1.5倍，高乙醇生产速率可达3结论为实现乙醇的高强度连续生产，本实验将连续细胞循环和真空发酵相结合。实验结果明，通过细胞连续循环，有效的提高了发酵液细胞浓度，系统稳定时的细胞浓度为458，讪过抽露空使发1哮液的乙醇浓度控制在3，4私消除了乙醇对酵母细胞的抑制作用。实验中乙醇生产速率参考文献1罗。5，拎蕊，孙。以4.削，化酵细，化汶酵生乙醇的研吨。湖大学7很自然料学版，1州1叫23秦庆军，曹鸿飞，王宇新发酵法生产乙醇研究进展。化工进林艳，单连菊，张沛，潘学启。高效液相色谱法测定啤酒发酵液和麦汁中的糖类和乙醇刀。分析化学，1999，6744葡萄糖乙醇及菌体浓度随发酵时间和稀释率的变化。在稀释率低于024之前，发酵过程中葡萄糖乙醇和菌体浓度基本保持稳定，不受稀释率变化的影响，乙醇生产速率随稀释率线性递增，当稀释率超过24时，发酵液中葡萄糖浓度开始上升，乙醇和菌体浓度则逐渐下降，乙醇生产速率也逐渐厂降。其变化规律与常压连续细胞循环发酵过程致。

　　在上述实验中，为避免高浓度乙醇的抑制作用，流加培养基的，萄糖浓度为。高乙醇产率为乙醇对葡萄糖收率048.

　　22连续细胞塘环真空发3拿由于常压连续细胞循环发酵工艺的产物乙醇不能及时分离，为避免高浓度乙醇的抑制作用，须限制流加培n基的葡萄糖浓度低于因而降低了乙醇生产速率。另外，早籼米糖化液的葡萄糖浓度通常在200，2508若采用述工艺则要将糖化液稀释，这将提高后续的无水乙醇制备序的能耗为此，本文将连续细胞循环与真空发酵相结合，从而实现了无乙醇抑制的高菌体浓度高流加葡萄糖浓度的高速率乙醇发酵。

　　连续细胞循环真空发酵是在常压连续细胞循环发酵的基础上进行的在常压连续细胞循环发酵的之后，开启真空发酵的制冷系统，21！之后，冷凝器温度降至1以下，开始抽真空，测葡萄糖和乙醇浓度降至所要求的浓度后，流加糖化液发酵培养基，开始连续细胞循环真空发酵发酵条件30，200叫自然，流加培养基的葡萄糖浓