高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于医疗卫生、食品等行业，结构简单可靠，操作简便。
使用步骤：
1)准备：首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂。加水最好加去离子水或蒸馏水，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。
2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间（在温度或者压力达到所需时（一般为121°0.1MPa），需要切断电源，停止加热。当温度下降时，再开启电源开始加热，使温度维持在恒定的范围之内。因为温度太低达不到灭菌效果，太高可能会出危险。现在市场上手提灭菌锅实现了控制自动化，不过因为灭菌压力比较大，最好还是有人在现场比较保险）。
5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，10分钟后取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，关闭锅盖上的气阀。
注意事项：
1.灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。
2.降温时待温度自然降至60℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂
3.在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。
由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
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