关于维生素A的含量测定方法

　　因为含维生素A原料中常常混有许多杂质，包括异构体，氧化降解产物，合成中间体，副产物等有关物质，且含有稀释用油，这些杂质在紫外区也有吸收，导致在维生素A最大吸收波长处测得的吸光度并不是维生素A独有的吸收，为了消除其他物质引起的误差，所以采用三点校正法。

　　三点波长的选择原则：一点选在维生素A的最大吸收波长处，其他的两点各在这一波长两侧选一点。这两点有两种选择方法，第一种是等波长差法，即最大吸收波长为328nm，左侧一点为316nm，右侧一点为340nm.这是10版药典规定测定维生素A醋酸酯的方法。第二种方法是等吸收比法，即左右两波长处的吸光度相等等于最大吸收波长处吸光度的七分之六。10版药典规定测定维生素A醇时用此方法。

　　1．原理

　　维生素A的异丙醇溶液在325 nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。本法的灵敏度较比色法高，可测定维生素A含量低于5?g／g的样品。主要缺点是在维生素A最大吸收波长325 nm附近许多其他化合物也有吸收，干扰测定，故本法适用于透明鱼油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对于一般样品，测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化，萃取其不皂化部分，再经柱层析除去干扰物。

　　2．仪器

　　紫外分光光度计; UV-1100;UV-1200。

　　3．试剂

　　①异丙醇。

　　②维生素A标准溶液：称取1 g相当于50 000国际单位维生素A的浓鱼肝油0．1000 g，加异丙醇溶解，定容至125 mL。此溶液1 mL相当于40国际单位(即40 IU．mL-1)。

 

　　4.测定步骤

　　①标准曲线绘制：分别取维生素A标准溶液(40 IU·mL-1)O．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、4.0 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用异丙醇定容。以空白液调仪器零点，于紫外分光光度计上在325 nm波长下分别测定吸光度，绘制标准曲线。

　　②样品测定：称取适量样品，按照三氯化锑比色法进行皂化、提取、洗涤、浓缩、蒸发醚层后，迅速用异丙醇溶解并移人50 mL容量瓶中，用异丙醇定容，于紫外分光光度计325nm处测定其吸光度，从标准曲线上查出相当的维生素A含量。

　　5．计算X=[(c*V)/m]*100

　　式中：

　　X——样品维生素A的含量，IU·(100 g) -1；

　　c——由标准曲线查得的维生素A含量，IU·mL-1；

　　V——样品的异丙醇溶液体积，mL；

　　m——样品质量，g。

　　为何不直接以紫外可见分光光度法测定维生素A的含量,而要采用较为繁琐的三点校正法

　　牛胸腺DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 6 600,DNA 含磷量9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐溶液光密度0.020.RNA 溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 7 700~7 800,RNA 含磷量9.5%,含1μg /mL RNA 溶液光密度0.022~0.024.采用紫外光光度测定核酸含量,通规定：260nm 波,浓度1μg/mL DNA 溶液其光密度0.020,浓度1μg/mL RNA 溶液其光密度0.024.,测定未知浓度DNA （RNA）溶液光密度OD260nm,即计算测其核酸含量.该简单、快速、灵敏度高,核酸3μg／mL 含量即测.于含微量蛋白质核苷酸等吸收紫外光物质核酸品,测定误差较,若品内混杂量述吸收紫外光物质,测定误差较,应设事先除.

　　由于降解或水解作用,核酸光密度增高约40％,众所周知增色效应（hyperchromic effect）.核酸,氢键π-键相互作用改变碱基共振行.,核酸光密度低于构核苷酸光密度,该现象称减色效应（hypochromic effect）.

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