目 录
绪论
(1)国内外研究现状
(2)生物冶金发展趋势及前景
(3)冶金微生物
(4)浸矿体系中的微生物
(5)冶金微生物的多样性
(6)环境微生物多样性的研究方法
(7)双层固体平板法
(8)本文的研究目的和意义
1试验材料与仪器
1.1菌株来源
1.2主要仪器
1.3培养基
1.3.1液体培养基
1.3.2固体培养基
2 试验方法
2.1活性培养
2.1.1富集方法
2.1.2 Fe分析方法
2.2 菌株的筛选和纯化
2.2.1 稀释涂布法
2.3 菌株的鉴定
2.4.1 菌株的鉴定
2.4.2单菌落的富集培养
2.4.2.1氧化亚铁硫杆菌属
2.4.2.2氧化硫硫杆菌属
2.4.2.3异养菌类
2.4.3基因组DNA的提取
2.4.3.1蛋白酶K法
2.5 最佳生长条件探讨
2.5.1铁杆菌
2.5.1.1初始pH值的影响
2.5.1.2接种量的影响
2.5.1.3温度的影响
2.5.2硫杆菌
2.5.2.1不同底物对生长的影响
3 试验结果分析与讨论
3.1 活性培养结果分析
3.1.2 铁氧化速率
3.2 菌株筛选结果
3.2.1铁杆菌
3.2.2硫杆菌
3.2.3异养菌
3.3菌株鉴定结果
3.3.1菌体形态特征
3.3.2显微观察
3.3.2.1普通染色法观察结果
3.3.2.2革兰氏染色结果
3.3.3基因组DNA提取
3.3.3.1 蛋白酶K提取DNA电泳结果
4.3.3.2 16Sr PCR结果
3.4铁氧化曲线
3.4.1 :总铁的变化情况
3.4.1.1细菌氧化Fe2+的机理
3.5生长因子
3.5.1铁杆菌A6
3.5.1.1初始pH
3.5.1.2温度
3.5.1.3接种量的影响
3.5.2硫杆菌B1
3.5.2.1 B1对单质S的利用
3.5.2.2硫杆菌B1对Na2S2O3的利用
3.5.2.3硫杆菌B1对Na2SO3的利用
结 论
参考文献
绪论
当今世界金属矿产资源日益枯竭，随着富矿、易开采矿不断挖掘，低品位、边界品位矿及尾矿大量堆积，常规冶炼方法成本过高，使这部分矿产资源不能够利用。生物冶金因具有成本低、生态环境友好而成为近年来各国争相研究的热点，并已实现工业化。生物冶金是近代学科交叉发展生物工程技术和矿物加工技术相结合的工业上的一种新工艺[1]。按微生物在冶金过程中的作用，生物冶金可分为生物浸出、生物氧化、生物吸附和生物积累[2]目前生物冶金技术已经在提取低品位难处理矿石中的金属方 面得到大规模的应用，提取的金属包括铜、金、镍、锌、钴、铀等。生物冶金生产的铜、金、铀分别占世界总产量的15%、25%、13%[3]，因此生物冶金具有广阔的前景。
（1）国内外研究现状
难浸金矿的细菌氧化预处理，最先1946年在法国提出，但一直到20世纪80年代中期1986年第非金科公司投产时，生物湿法冶金才开始推广到其它金属的提取[4]。自1980年以来，智利、美国、澳大利亚等国相继建成了大规模铜矿物堆浸厂，锌、镍、钻、铀等金属的生物提取技术亦得到研究。加拿大用细菌浸铀规模最大、历史最久，安大略州伊利埃特湖区三铀矿公司1986年产铀360t。智利北部的Qubeard Balanac矿山是目前生物浸出实践中非常好的范例，并展示了生物湿法冶金在矿业中的成功发展。我国史书记载“禹收九牧之金，铸九鼎，象九州。”说明早在原始社会就具有冶金能力了，公元11世纪记载有“胆水浸铜”，可见古人很早就会利用生物冶金技术。在国内，微生物浸矿的研究始于20世 纪60年代，中科院微生物研究所对铜官山铜矿进行 试验研究，后因种种原因而一度停止。20世纪70年代初，在湖南711铀矿进行了处理量为700t贫铀矿石的细菌堆浸扩大试验[5]。核工业北京化工冶 金研究院在抚州铀矿厂进行半工业细菌堆浸试验回收铀1142.14kg[6]。2000年我国第一座年产50t规模的难浸金精矿生物氧化—氰化提金车间在烟台市 黄金冶炼厂正式投产，标志着我国细菌氧化技术在难处理金矿提金工艺中已经从科研阶段转向正式工 业生产[7]。在铜矿开采中，1997年5月，德兴铜 采用细菌堆浸技术处理含铜0. 09%～0. 25%的废石，建成了生产能力2000t/a的湿法铜厂[8]。福建紫金铜矿已探明的铜金属储量253万t，属低品位含砷铜矿，铜的平均品位0.45%，含As2037%。该矿采用生物堆浸技术浸出铜，并建成了年产300t阴极铜的试验厂，目前正在进行建设年产20000t阴极铜的微生物堆浸厂的前期工作。此外，紫金山铜矿还将利用这一新工艺着手进行生产有色金属纳米材料和其它新型粉体材料及复合粉体材料的研究，逐步实现传统矿业经济向新型经济产业迈进，力争在五年内把紫金矿业建设成为国内著名的高科技效益型矿业企业集团，并实现紫金山铜矿的全面开发。
(2) 生物冶金发展趋势及前景
生物冶金因其有利于环境保护、基建投资少、在某些情况下运作成本低等优越性，将获得进一步的发展。目前研究热点集中于菌种选育，微生物—矿物界面相互作用本质及其反应速度控制步骤，对原生硫化矿提取高效冶金细菌，加强细菌对重金属离子及有毒离子的适应性，浸矿微生物生态规律、遗传及代谢调控机制。工艺及工程方面发展趋势为:适应气候变化的高效细菌，堆浸和就地浸出的水文地质及矿物学研究，浸矿工艺流程的优化以及生物冶金规模化，微生物应用于矿山废水以便从水溶液提取贵金属，对其它非金属矿进行生物浸矿探索。
(3) 冶金微生物
1947年，Colmer和Hinckle[9]首先从酸性矿坑水中分离出能氧化硫化矿的氧化亚铁硫杆菌，其后Temple[10]和Leathen[11]对这种自养细菌的特性进行了研究，发现这种细菌能将Fe2+氧化成Fe3+，并能把矿物中的硫化物氧化为硫酸。经过半个多世纪的研究，能够应用生物冶金的细菌有几十种，按它们生长的最佳温度可以分为三类:中温菌(20～40℃)、中等嗜热菌(40～60℃)与高温菌(大于60℃)。它们可以同时把铁和硫作为能源，而一些原核生物只能氧化其中之一作为能源[12]。冶金环境中的微生物是多样的，至今已经报道有13个属类的细菌能够氧化浸出金属硫化物，即Acidianus、Acidimicrobium、Acidiphilium、Acidithioba- cillus、Ferrimicrobium、Ferromicrobium， Ferroplasma， Leptospirillum、Sulfobacillus、Sulfolobus、Sulfurispha- era、Thermoplasma和Thiobacillus。还有一些属的细 菌能够在酸性条件下生长，目前还没有发现它们的 作用，但是不能够排除这种可能性。这些属包括 Acidisphaera、Acidiobacterium、Alicyclobacillus、Acidi- omonas、Acidiothermus、Picrophilus、Frateuria， Halo- thiobacillus、Propionibacterium和Thiomonas[13]。常用的浸矿细菌主要有:嗜酸性氧化硫硫杆菌 (Acidithiobacillus thiooxidans)、嗜酸性氧化亚铁铁 杆菌(Acidiferrobacillus ferrooxidans)、嗜酸性氧化亚 铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、硫化叶菌属(Sulpolobus)。其中使用最多的是A.t ferrooxi- dans和A.t thiooxidans，尤以前者的生物氧化研究最为深入[14]。
(4) 浸矿体系中的微生物
生物浸出中使用的主要是化能自养微生物，此类微生物可从无机物的氧化过程中获得能量，并以CO2为主要碳源和以无机含氮化合物作为氮源合成细胞物质；又可进一步细分为硫化细菌、氢细菌、铁细菌和硝化细菌等4种生理亚群[15，16]。在硫化矿生物浸出中应用最多的为硫化细菌，在有空气(含有电子受体和少量CO2)、一定的pH、温度及一定的含氮无机物情况下，硫化细菌就能生长繁殖，并将元素S和某些还原态的硫化物氧化成S042-从中获得能量。其中嗜酸氧化亚铁硫杆菌还能氧化金属硫化物，将Fe2+离子氧化成Fe3+离子，三价铁盐是湿法冶金中常用的氧化剂。因此有色冶金中利用嗜酸氧化亚铁硫杆菌在常温酸性溶液中，进行硫化矿石或精矿浸出，使金属硫化物转变为可溶性硫酸盐[17]。按作用的温度这些菌种可分为:中温菌种(msophiles，20-40℃)、中等嗜高温菌种(moderatethermophiles，40-60℃)、嗜高温菌种(thermoples，>60℃)[15-16]。特别是近年来从含硫丰富的酸性热泉水中分离出的酸热硫化叶片菌、嗜酸热硫球菌以及嗜热嗜酸酸杆菌甚至可在更高的温度下用于硫化矿的酸性浸出[16-18]。矿物浸出体系中所涉及到的微生物种类是多种多样的，主要有化能自养菌、异养菌和真菌[19，20]，此外也有原生动物存在[21]。其中己用于硫化矿生物浸出的菌种主要有嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.f)、嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans，简称At)和氧化亚铁微螺菌(Leptospirillum ferrooxidans，简称L.f)。其中嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Af可以氧化Fe2+离子、元素硫和还原态硫化物，嗜酸氧化硫硫杆菌(A.t)能氧化元素硫，不能氧化Fe2+离子；氧化亚铁微螺菌(Lf能氧化Fe2+离子，但不能氧化元素硫[18]。除以上几种主要浸矿细菌外，目前许多研究发现，在硫化矿堆浸体系、硫化矿酸性废水以及酸性温泉中存在其它多种微生物[19，22].在一些堆浸体系和矿山废水中，由于地热或硫化物氧化产生热量，使这些体系中存在着温度梯度，不同温度生态适应性的细菌生活在不同的温度环境中。在40℃以下的环境中，主要的微生物是嗜酸氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌。在温度为40-50℃的环境下，主要是硫叶菌属等中等嗜高温菌细菌。在温度超过50℃的极端环境下，只有硫化叶菌等少数几种嗜高温的微生物存在[23]。这些高与此同时，HerbertL等人还从浸矿体系中发现大量异养细菌，包括中温细菌、嗜热细菌和嗜热古细菌[23] 多项研究表明混合微生物群落存在协同浸矿作用，混合种群细菌间的协同作用可以优化环境中群落活性，互相取长补短，使彼此更好地得到生长，进而促进矿物的氧化，其浸矿效果比单菌种更好。研究表明异养菌(如AcidiPhilium spp.)能消化浸矿体系中自养菌的有机代谢产物及残体，降低有机物对自养菌的毒害作用，并能产生维生素、辅因子、鳌合物和表面活性剂，促进自养浸矿细菌的生长及其对金属硫化物的浸出作用。硫氧化细菌(如AL.aldus)可以代谢硫化矿氧化溶解时表面覆盖的单质硫，保证Fe3+能够连续地氧化，硫化矿表面的含硫基团产生Fe2+供铁氧化细菌生长同时阻止或延缓矿石表面硫膜的形成而促进对金属硫化物的浸出[23，24，25]。
共培养的铁氧化菌L.ferrooxidans和硫氧化菌A.thtoox或ALca比单一菌种对黄铜矿具有更高的溶解效率[26]。Fcihilus和A.thtooxidans的混合培养物能够氧化黄铁矿，但是单菌种不具备此能力。铁氧化菌属如bacillussPp.和A.ferrooxidans的共生可使混合种群在无有机物存在的情况下快速氧化亚铁离子[27]。虽然A.ferrooxidans的铁氧化速率比sthermosu dooxidans低，但是其二氧化碳固定能力却比sthermosu dooxidans强，因此两者共培养可以快速氧化亚铁离子。
(5)冶金微生物的多样性
随着微生物对硫化矿的不断氧化，其周围环境条件如pH、温度和溶液中可溶性金属离子的浓度也不断发生变化，这些特殊的环境条件必然限制了生命形式的多样性，因此，在生物出槽或堆或反应器中存在的生命形式比较简单，往往属于单细胞生物，而且其优势菌群主要是细菌和古生菌。它们大多数生活在pH
(6)环境微生物多样性的研究方法
环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上包括以下四类:(1)传统的微生物平板纯培养方法； (2) Biolog微平板分析方法；(3)磷脂脂肪酸法(PLFA)；(4)分子生物学技术方法等。
(7) 双层固体平板法
双层固体平板法是本实验的关键技术，通过对传统单层平板培养 技术的改良，把单层改为上下两层，并在下层平板 加入SJH(Acidiphilium sp. ) 菌株。SJH 菌来自英 Bangor大学嗜酸性研究室，是一种异养性嗜酸性细 菌(Acidiphilium sp. ) ，在静置条件下，能将Fe3 +还原为Fe2 + ，从中获得能量生长。其基本原理是处于饥饿状态的SJH菌株能够利用任何游离的单糖分子和化能无机自养细菌代谢产生的废物，从而使无机自养细菌获得理想的生长环境。
(8) 研究目的和意义
生物湿法冶金的发展己有数十年的历史，由于成本低、无污染、操作简单而日益受到人们的重视，尤其适用于我国矿产资源品位低、成分复杂的显示情况。菌种研究是湿法冶金的研究重点，而嗜酸性菌在浸出矿物的应用中，由于减少了工业反应器的冷却设备，提供了更多的优越性，具有极大的应用前景。
本文旨在通过对中温反应器当中微生物群落组成结构研究，分离筛选出其中的部分优势菌株，对其最适生长环境进行探讨，进一步加深对中温嗜酸微生物浸矿的了解，为以后的大规模工业应用提供可资借鉴的数据和经验。
研究内容包括:
(1) 山南矿区堆浸实验六个采样点活性分析
(2) 对活性最佳的群落进行分离筛选得到单菌落
(3) 对得到的单菌落进行鉴定和最佳生长环境的研究
1试验材料与仪器
1.1 菌株来源：
721矿山5000吨堆浸实验采取酸化处理后矿样S1，S2，S3，S4，S5，S6。
采样用镐头挖去表层15cm的矿石后用小铲子采集矿石装与废矿泉水瓶内，做好标记贴上标签。取样位置见图1.
图1 取样位置示意图
1.2 主要仪器
BT 224S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司
SHZ-82A气浴恒温振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司
雷磁PHS—3C精密pH计 上海精密仪器有限公司
UV-1600紫外、可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司
SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司
DNP-9082BS-Ⅲ电子恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司
手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械制造有限公司
TGL-16C高速离心机 上海安亭科学仪器厂
GL-21M型高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司
XSD-01光学显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司
PCR仪 德国艾本德公司
M70型制冰机 美国格兰特中国制冷设备制造有限公司
凝胶电泳和紫外成像系统
1.3培养基
1.3.1液体培养基
9K(A液) :(NH4)2 SO4 3.0g/L， KCl 0.11 g/L， K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L， Ca (NO3)2 0.101 g/L， pH 1.8；
9k (B 液) : FeSO4·7H2O 25 g/ l， pH 1.8。
Waksman: (NH4 ) 2 SO4 0.12 g/L，K2HPO4 3.100 g/L， MgSO4·7H2O 015 g/L
CaCl2 0.1126 g/L，硫粉5g/L，pH4.0。
HBS (50倍异养基础盐溶液) : Na2 SO4· 10H2O 7.15 g/L， ( NH4 ) 2 SO4 2.215 g/L， KCl 2.15 g/L，MgSO4 ·7H2O 2.5 g/L， KH2PO4 2.15 g/L， Ca (NO3 ) 2 ·4H2O 0.17 g/L。
YF: 50 倍HBS 20 mL，酵母提取物0.12 g/L， Fructose 0.13 g/L， TE 1mL， pH 3.0。
上述选择性培养基采用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min，冷却至室温备用； FeSO4 ·7H2O 采用滤膜法除菌。
1.3.2 固体培养基
FeO: A液: 50倍HBS 8 mL， tryptone soya broth 0.11g， 0.14 ml TE， H2O 276 mL，pH 2.5；
B 液: agarose 2.18 g， H2O 100 mL；
C液: FeSO4 ·7H2O 1M /L。
iFeO:去掉FeO中的tryptone soya broth即可。
FeSO: A液:50倍HBS 8mL， tryptone soya broth 0.11 g， 0.12 mL TE， H2O276 mL；
B 液: agarose 2.18 g， H2O 100 ml；
C液: FeSO4·7H2O 1mol/L。
YF : A液: 50倍HBS 8 mL，酵母提取物0.108 g， Fructose 0.112 g， TE 0.14 mL， H2O 292 mL， pH 310；
B液: agarose 2.18 g， H2O 100 mL；
C液: FeSO4 ·7H2O 1mol /L 。
四种选择性固体培养基FeO，iFeO，FeSO，YF前三种为双层固体平板，分上、下两层，除下层培养基中添加SJH菌外，其它成分相同。双层固体平板法是本实验的关键技术，通过对传统单层平板培养技术的改良，把单层改为上下两层，并在下层平板 加入SJH (Acidiphiliumsp ) 菌株。SJH菌来自英Bangor大学嗜酸性研究室，是一种异养性嗜酸性细菌(Acid iphiliumsp ) ，在静置条件下，能将Fe3+还原为Fe2+ ，从中获得能量生长。其基本原理是处于饥饿状态的SJH菌株能够利用任何游离的单糖分子和化能无机自养细菌代谢产生的废物，从而解除有机物对无机自养细菌的生长抑制。
FeO平板用于分离铁氧化兼性或异养菌；
iFeO平板用于分离铁氧化自养菌；
FeSO平板用于分离硫氧化或铁硫氧化兼性菌；
YF平板为单层，用于分离以有机物为能源的嗜酸性异养细菌或真菌(Johnson， 1995)。各种培养基与琼脂糖分别经高压蒸汽灭菌后冷却至50℃左右(琼脂糖温度可稍高至65℃)混合，分别加入所需量的经滤膜法灭菌的FeSO4·7HO2、连四硫酸钾。下层培养基在45℃时接种入5% SJH，充分混匀，迅速倒入平板，待凝固后倒入上层。通常平板制备好后需室温放置2～3d，置4℃冰箱冷藏。
2 试验方法
2.1活性培养
2.1.1富集方法
分别取矿样10g在无菌条件下接种到已灭菌的9K+S+Fe液体培养基中， 35℃，130r/min条件下气浴振荡培养。每隔一定的时间测定Fe2+的转化情况，当Fe2+转化率达到95%-98%时终止，保存。
2.1.2 Fe分析方法
液体培养以Fe2+转化为Fe3+的转化速率反映铁氧化细菌的活性；硫氧化细菌活性以pH值的变化为依据。Fe2+、Fe3+采用EDTA滴定法；准确量取1ml待测液，加入1滴1mol/L HCl、1滴显色剂结晶紫、5滴10%磺基水杨酸，此时溶液颜色为红褐色，用标定好的1mol/L的EDTA滴定，颜色变为浅黄色时为滴定终点，此时测定的数值为Fe3+含量。加入氧化剂过硫酸铵可以将溶液中的Fe2+氧化为Fe3+，继续滴定，滴定终点刻度为总Fe含量。Fe2+含量为总Fe含量减Fe3+含量。
2.2 菌株的筛选和纯化
2.2.1 稀释涂布法
取1mL富集培养菌液按无菌操作梯度稀释到10ˉ8，分别取10ˉ6、10ˉ7、10ˉ8稀释度的菌液0.1mL涂布于固体iFeo，FeSO，YF培养基平板上，置35℃恒温培养箱培养。
2.3 菌株的鉴定
2.3.1 菌株的鉴定
通过对细菌菌落形态特征、显微镜下细菌形态观察、细菌的生理生化特性；DNA提取，16S rPCR ，将细菌进行分类鉴定[微软中国1] 。
[微软中国2] [微软中国3] 2.3.2单菌落的富集培养
2.3.2.1氧化亚铁硫杆菌属：
先用接种环挑取单菌落，接种到1ml iFeo培养基的离心管中，做好标记。该离心管在35℃恒温培养箱内培养，直到颜色变成棕红色。在超净工作台内转接到含5mL iFeo培养基的试管中，35℃气浴摇床内培养到颜色至棕红色。再将该试管转接到50ml 9K+Fe培养基中扩大培养。
2.3.2.2氧化硫硫杆菌属：
先用接种环挑取单菌落，接种到1ml FeSO培养基离心管中，做好标记。该离心管在35℃恒温培养箱内培养，直到颜色变成蛋黄色。在超净工作台内转接到含5ml FeSo培养基的试管中，35℃气浴摇床内培养到颜色至黄色。再将该试管转接到50ml 9K+S培养基中扩大培养，将扩大培养得到的菌液离心得到菌体。
2.3.2.3异养菌类：
挑取但菌落接种在5ml 5倍固体YF平板浓度培养基中，扩大培养后接种到50ml pH值为2.0的 LB培养基内。 LB培养基先高压蒸汽灭菌，在超净工作台内用已灭菌的pH为0.5的硫酸调节pH。
2.3.3基因组DNA的提取
2.3.3.1蛋白酶K法
离心收集的细胞用TE缓冲液洗涤3-4次以去掉高价铁离子沉淀。细胞破壁之前，上述细菌细胞重新悬浮于400ul pH8.0的TE缓冲液中，并于70℃温育10min，以破坏可能存在的DNA酶的活性。稍冷却后，在上述悬浮液中加入4ul20%(w/v)的SDS和5ul 20mg/ml的蛋白酶K，55℃温育15min。然后，加入等体积的氯仿/戊醇(24/l，v/v)混匀后， 12000rp/min 10min，将上清液小心地吸入到新的EP管中，重复一次；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇，并置于-20℃ 20min或过夜。5000rpm离心5min收集DNA沉淀，沉淀用70%的乙醇洗涤三次后，自然干燥并将沉淀溶于适量的pH8.0的TE缓冲液中。在溶有DNA的缓冲液中加入最终浓度为 20µg/ml的RNase A， 37℃90min。最后，依次用等体积的酚/氯仿/戊醇(25/24/l，v/v)和氯仿/戊醇(24/1，v/v)各抽提一次，无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗涤三次。纯化后的DNA分别用5µl的pH8.0的TE缓冲液和去离子水溶解，4℃保存备用。
2.3.4 16sr DNA PCR扩增
所用的引物序列如下所示：
16SP1：5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇
16SP2：5＇－GGTTACCTTGTTACGACTT－3＇
扩增反应体系如下：
ddH2O 4.3μL
2×GC buffer 12.5μL
dNTPs 2μL
16SP1 0.5μL
16SP2 0.5μL
LA Taq（5U/μL） 0.2μL
模板DNA 5μL
总体积 25μL
PCR扩增反应条件为：94℃变性3min；94℃，1min， 48℃，30s； 72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。0.68%的琼脂糖电泳检测（上样量：3μL DNA+3μL的2×buffer)。-20℃保存。
2.4 最佳生长条件
2.4.1铁杆菌：
在35℃气浴摇床，转速为130r/min，接种量为10%，pH=2.0的条件[微软中国4] 下，研究微生物生长状况，以Fe3+为指标，绘制微生物的铁氧化曲线。
2.4.1.1初始pH值的影响
在9K+Fe培养基，35℃气浴摇床，转速为130r/min，接种量为10mL的条件下，研究培养基不同初始pH对微生物生长状况(以氧化率达到98%所需要的时间计)的影响。调节初始pH为 1.0、1.5 、2.0 、2.3、2.5 、3.0。
2.4.1.2接种量的影响
在9K+Fe培养基，35℃水浴摇床，转速为130r/min，pH=2.3的条件下，研究培养基不同接种量对微生物生长状况(单位时间铁的转化量计)的影响，接种量分别为5%、10%、20%、25%、30%、50%。
2.4.1.3温度的影响
在9K+Fe培养基，转速为130r/min的气浴摇床，接种量10%，pH=2.3的条件下，研究培养基不同温度对微生物生长状况(铁的转化情况计)的影响，调节温度为25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、.
2.4.2硫杆菌：
2.4.2.1不同底物对生长的影响：
方法
配制不含Fe2+的9K培养基，分别加入单质S、Na2S2O3和Na2SO3，以S计，加入S的浓度为1g/L，即0.03mol/L，于35℃，130r/min条件下培养。由于硫化合物的氧化生成硫酸，是一个产酸过程，可用溶液pH值的降低程度表示硫化合物被细菌氧化量的多少，因此，按一定时间间隔测定溶液中pH值考察硫杆菌对硫化合物的利用情况。pH值由pH计测定。
3 试验结果分析与讨论
3.1 活性培养结果分析：
3.1.1 pH变化情况：
图2 S1-S6在9K+S+Fe培养基pH变化情况
同图2可见，S2，S3，S5，S6 pH呈现先上升后下降的趋势，培养0-18h时段氧化亚铁硫杆菌占优势，Fe2+氧化为Fe3+很活跃pH呈现上升趋势，此时氧化硫硫杆菌受到抑制，培养到20h后，氧化亚铁硫杆菌因为底物不足受到抑制，氧化硫硫杆菌为优势菌株，单质S氧化为SO42-产生H+ pH下降。
S1先下降后上升，表明在培养初始阶段，硫杆菌延缓期比较短，先进入对数生长阶段。中后期铁杆菌进入快速生长阶段，硫杆菌生长受到抑制。
S4，pH值整个阶段变化不大，表明生长过程中两类细菌平衡且呈一定比例。
3.1.2 铁氧化速率：
图3 S1-S6在9K+S+Fe培养基培养过程Fe氧化情况
由图可以看出，S1-S6生长曲线呈S型，接种0-10h为延滞期10-20h 为对数生长期，Fe2+迅速氧化为Fe3+，25h之后由于产物的积累，铁氧化速率变缓，转入衰亡期。纵向比较发现S3生长速率较快，单位时间内氧化Fe2+的量最多，最先Fe2+氧化率达到98%。
3.2 菌株筛选结果：
通过划线法，涂布倒平板法，极限稀释法得到多个单菌落。重点研究了活性最佳的S3菌群。从S3筛选得到6种菌落形态不同的铁杆菌，1种硫杆菌和3种异养菌。
3.2.1铁杆菌：
图4 S3在 iFeo平板上分离得到的A1菌株[微软中国5] 培养时间10天
表1 A1菌落形态特征
菌株 | 形状 | 直径（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀圈直径 |
A1 | 圆形 | 0.5-0.8 | 规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 微小可见 |
图5 S3在 iFeo平板上分离得到的A2菌株 培养时间8天
表2 分离株A2形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀d |
A2 | 圆形 | 2-3 | 不规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 0.5mm-1.5mm |
图6 S3在 iFeo平板上分离得到的A3菌株 培养时间8天
表3 分离株A3形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀d |
A3 | 圆形 | 3-8 | 不规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 2mm-5mm |
图7 S3在 iFeo平板上分离得到的A4菌株 培养时间7天
表4 分离株A4形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀d |
A4 | 圆形 | 10 | 规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 6mm |
图8 S3在 iFeo平板上分离得到的A5菌株 培养时间8天
表5 分离株A5形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀d |
A4 | 圆形 | 3-6 | 规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 2mm-4mm |
图9 S3在 iFeo平板上分离得到的A4菌株 培养时间7天
表6 分离株A6形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 | 中心有无Fe沉淀 | Fe沉淀d |
A4 | 圆形 | 1-3 | 规则 | 不透明 | 红褐色 | 有 | 0.5mm-1mm |
3.2.2硫杆菌：
图10 S3 在FeSO平板分离得到的B1菌株 培养时间5天
表7 分离株B1形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 |
B1 | 椭圆形 | 12 | 规则 | 不透明 | 中心蛋黄色外围白色 |
3.2.3异养菌
图11 S3 在YF平板分离得到的C1菌株 培养时间4天
表8 分离株C1形态特征表
菌株 | 形状 | 大小d（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 |
C1 | 圆形 | 50 | 规则 | 不透明 | 中心棕褐色外围白色 |
图12 S3 在YF平板分离得到的C2菌株 培养时间3天
表9 分离株C2形态特征表
菌株 | 形状 | 大小（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 |
B1 | 圆形 | 3-5 | 不规则 | 不透明 | 中心白色外围白灰色 |
图13 S3 在YF平板分离得到的C3菌株 培养时间3天
表10 分离株C3形态特征表
菌株 | 形状 | 大小（mm） | 边缘 | 透明 | 颜色 |
B1 | 圆形 | 5 | 规则 | 不透明 | 外层透明中层白色内层褐色 |
由于A6平板形态比较特殊，本实验室比较少见，所以本文对A6进行重点研究
3.3菌株鉴定结果
3.3.1菌体形态特征
该菌在固体培养基上培养时，培养基的颜色由最初的浅绿色变为黄绿色，约5天左右在培养皿上长出小菌落，该菌落为黄褐色、圆形，直径约0. 5—0. 中部突起，被水合高铁包裹，质地坚硬，较难挑起。在显微镜下该菌为短杆状，两端钝圆，以单个、双个或几个呈短链状存在，能运动，革兰氏染色阴性，用测微尺量得菌体直径约0.5-0.7um，长度约1.2-1.8um。
3.3.2显微观察:
3.3.2.1番红染色观察结果:
菌株A6:
形状: 短杆状，两端钝圆，以单个、双个或几个呈短链状存在
图14 A6在光学显微镜下400倍 染色液为番红染液
3.3.2.2革兰氏染色结果:
革兰氏染色:阴性
图15 A6革兰氏染色情况：光学显微镜1000倍下观察
3.3.3基因组DNA提取
3.3.3.1蛋白酶K提取DNA电泳结果
如图所示
图16 为A6 蛋白酶K法提取DNA 琼脂糖凝胶电泳图
（上样量: 3μL DNA+3μL 2×buffer ）
D 箭头所指W1为目的DNA
3.3.3.2 16Sr PCR结果
图17 为A6 16s rDNA PCR结果图
（P1为Marker，P2，P3，P4为PCR产物电泳图，p5为阴性对照，上样量：3μL DNA+3μL 2×buffer）
如图（17）所得电泳条带结果显示：所得PCR产物片段为1500bp，与预计结果相吻[微软中国6] 合。[微软中国7]
3.4铁氧化曲线
s
图18 为A6在9K+Fe培养基中35℃ 130r/min 绘制的铁氧化曲线
由图（18）可以看出，在接种后的初始阶段，由于生存环境的变化，细菌处于延迟期，活性很低，细胞基本不分裂或分裂很少，细菌数量基本维持恒定，所以接种后前5h内培养液的Fe3+变化较小，细菌对铁的氧化速率相对较低.10h后开始出现对数生长，20h 左右达到稳定期.
3.4.1 :总铁的变化情况：
图19 为A6在9K+Fe培养基中35℃ 130r/min 绘制的总铁变化曲线
由图（19）可见，在细菌培养过程中，溶液的总铁含量随时间变化呈下降趋势，这是由于Fe2+被细菌氧化为Fe3+后，Fe3+又发生水解反应:
4Fe2++2H++O2→2Fe3++2H2O (1)
Fe3++H2O→FeOH2+H+ (2)
Fe3++2H2O→Fe(OH)2+2H+ (3)
Fe3++3H2O→Fe(OH)3+3H+ (4)
3Fe (OH)3+4SO2-4+3Fe3++3H2O+2NH+4→2[NH4Fe3(SO4)2(OH)6]+3H+ (5)
试验中发现，在细菌培养过程中，三角瓶内壁和瓶底逐渐生成一层黄色的沉淀物———黄铵铁矾[NH4Fe3(SO4)2(OH)6][4]。在生物脱硫和细菌浸矿中，该沉淀可占据载体表面，影响底物与代谢产物的传递，导致营养供应不足，降低细菌氧化速率
3.4.1.1细菌氧化Fe2+的机理
从反应式(1)可以看出，在Fe2+被细菌氧化为Fe3+过程中， Fe2+为电子供体，O2为电子受体。电子由Fe2+传送至O2的过程中，菌体起着传导电子的作用[29]，并将细胞色素c向分子氧递送过程中所
释放的能量贮存在ATP中供生长需要[30]。所以，Fe2+的氧化速率是电子传导速率的间接反映，可以描述细菌的生长活性
3.5生长因子
3.5.1铁杆菌A6
3.5.1.1初始pH
在35℃气浴摇床，转速为130r/min，接种量为10mL的条件下，研究培养基不同初始pH对微生物生长状况(培养24h不同出始pH铁氧化百分率计)的影响，实验果如图所示。从图可以看出，随着培养液的初始pH值的不断增大，氧化率逐渐增大，当培养液初始pH值达到2.30后氧化率最高达到98%，当达到2.5后，氧化率迅速下降.因此，氧化亚铁硫杆菌生长的最佳初始pH值约为2.30.当pH超过3.0时生长受到抑制.
图20 为A6在9K+Fe培养基中35℃ 130r/min 不同初始pH，培养24h二价铁氧化率
图21 为A6在9K+Fe培养基中35℃ 130r/min 不同初始pH，培养过程铁氧化情况
由图（20-21）可以看出当pH 为2.3时单位时间铁氧化速率最快。
本试验存在的不足与改进：
由于在不同的pH，空气也能将Fe2+氧化为Fe3+,所以应该做一组空白试验。
试验过程中发现9K培养基在pH>3时候不稳定，会出现沉淀现象。
3.5.1.2温度
温度的影响
从图（22）中可以看出，当温度适宜即为30℃～35℃左右时，迟缓期为10小时左右，说明细菌在这一温度范围内，可以非常迅速地适应培养液条件，吸收营养物质，转化Fe2+为Fe3+。而当温度超出或低于这一温度范围时，迟缓期都会有明显延长，说明细菌生长被抑制。
图22 为A6在9K+Fe培养基中pH 2.3 130r/min 不同温度，培养过程铁氧化情况
由图（22）表明温度在35℃时，生长最佳。
本实验存在的不足：本实验应该考虑到空气对Fe2+的氧化，也应该做一组空白对照。
3.5.1.3接种量的影响
接种量为1%-10%时争加接种量迟缓期的缩短呈线形关系，当接种量达到10%以后继续增大接种量迟缓期的缩短仅有微小变化，当达到50%时继续增大接种量反而会
增大迟缓期。分析认为这主要是因为，当接种适量增加时，进入培养液中的初始菌数增加，相应的在培养液中能够适应环境，具有较强活性的菌数也会增加，有利于氧化亚铁硫杆菌的快速繁殖。但由于培养液中的营养物质有限，加入过多的菌液也会影响细菌的生长繁殖。所以营养物质足够充分，其它条件合适的情况下应尽量加大细菌的接种量来对其进行培养。
图23 为A6在9K+Fe培养基中35℃ 130r/min 不同温度，培养过程铁氧化情况
由图（23）可以看出在1%-10%之间，单位时间内铁氧化速率随接种量的增加呈线性关系，接种量在10%-30%之间单位时间内铁氧化速率不再呈线性关系，接种量超过30%接种量增加，单位时间内铁氧化速率反而下降。
3.5.2硫杆菌B1
3.5.2.1 B1对单质S的利用
图24 为B1对单质硫氧化过程中PH变化情况
以单质S为底物时，B1生长过程中pH值的变化情况如图（24）可知，溶液中pH一直呈下降趋势，但在培养的前两10h溶液的pH值下降较缓慢，在第10h后，才有较大幅度下降，可能由于更换能源物质，细菌开始有一段延滞期，活性较差，需要通过自身生理机能的调节以适应新环境。细菌直接氧化单质硫，与它和单质硫的
直接接触有密切关系，涉及到菌体在固体颗粒表面吸附，同时细菌能产生一些表面活性物质，如磷脂酰甘油，能降低介质的表面张力，促进细菌与硫的直接接触。Kovaleva等[31].通过电镜观察发现，硫杆菌在元素硫培养基中生长时，有硫被细菌吸收并分布在细胞表面、细胞壁、细胞周质以及细胞色素中。Karavaiko等[32]发现吸收的元素硫形成直径为20～40nm的圆球，且细菌在稳定生长期对元素硫的吸收率最高。
单质硫被氧化硫硫杆菌氧化为硫酸可能经过下列步骤[33]：单质硫通过细胞壁进入细胞内部，与还原型胱苷肽（GSH）形成多硫化合物。谷胱苷肽多硫化合是硫氧化体系的活性物质。亚硫酸盐是硫氧化过程中的第一级产品。可能的反应如下：
S8+GSH→GS8SH（1）
GS8SH+O2→硫氧化酶→GS8SO2H（2）
GS8SO2H+H2O→GS7SH+H2SO3（3）
（2）SO32-通过硫磷酸腺苷（APS）作用进一步氧化成SO42-：
2SO32-+2AMP→硫磷酸腺苷还原酶→2APS+4e-（4）
2APS+2Pi→二磷酸腺苷还原酶→2ADP+2SO42-（5）
2ADP→AMP+ATP（6）
SO32-氧化过程中，能量以ATP形式储存。一旦硫被氧化成SO32-时，菌体对能源的利用变得较快。当硫杆菌B1以单质S为底物生长时，整个过程涉及到硫杆菌在固体颗粒表面的吸附及产物透过细胞壁扩散等一系列复杂的传质过程，由于硫杆菌B1在单质S颗粒表面的吸附速度较慢，使得该固相界面传质步骤成为单质S利用过程的限速步骤[34]。随着细菌对新环境的适应以及氧化硫的酶系统的启动，硫杆菌B1就以单质S为基质进行生长繁殖。
3.5.2.2硫杆菌B1对Na2S2O3的利用
图25 为B1对Na2S2O3氧化过程中PH变化情况
如图（25）可看出，溶液中pH值变化趋势与以单质S为底物时略有不同。由于Na2S2O3是弱碱性盐，溶液中有微量OH-解离，因此，加入Na2S2O3后，会导致溶液pH值升高，而此时细菌在新的环境中有一个适应过程，其活性也较低。经过两天的延滞期，细菌进入快速生长阶段，第30h时，溶液中pH值降至1.49。在培养的过程中可明显看到单质硫的小颗粒。这是由于NaS2O32一方面是强配体，又具有一定还原性，易被细菌的氧化酶氧化，另一方面Na2S2O3在酸性条件下不稳定，易发生歧化反应：Na2S2O3→Na2SO3＋S↓，分解产生的硫没能被细菌及时利用则聚集沉淀[35]。
3.5.2.3硫杆菌B1对Na2SO3的利用
图26 为B1对Na2SO3氧化过程中PH变化情况
在以Na2SO3为底物时，B1生长过程中pH值的变化情况如图26所示。由于Na2SO3为弱酸强碱盐，其投加后直接导致溶液pH值的升高。当细菌经过短暂的适应后，伴随菌体的生长，溶液pH值开始下降。前5h的时间内，pH值下降较快，之后，随着SO32-的减少，pH值的下降趋势减缓。
通过以上三张图对比我们可以判断，硫杆菌B1对硫的利用率是Na2S2O3﹥S﹥Na2SO3
结 论通过完成本次实验，总结出以下结论：
(1):活性培养发现S2，S3，S5，S6 pH呈现先上升后下降的趋势，培养0-18h时段氧化亚铁硫杆菌占优势，Fe2+氧化为Fe3+很活跃pH呈现上升趋势，此时氧化硫硫杆菌受到抑制，培养到20h后，氧化亚铁硫杆菌因为底物不足受到抑制，氧化硫硫杆菌为优势菌株，单质S氧化为SO42-产生H+ pH下降。
S1先下降后上升，表明在培养初始阶段，硫杆菌延缓期比较短，先进入对数生长阶段。中后期铁杆菌进入快速生长阶段，硫杆菌生长受到抑制。
S4，pH值整个阶段变化不大，表明生长过程中两类细菌平衡且呈一定比例。
S1-S6生长曲线呈S型，接种0-10h为延滞期10-20h 为对数生长期，Fe2+迅速氧化为Fe3+，25h之后由于产物的积累，铁氧化速率变缓，转入衰亡期。纵向比较发现S3生长速率较快，单位时间内氧化Fe2+的量最多，最先Fe2+氧化率达到98%。
(2):S3通过平板分离，极限稀释法分离得到铁杆菌6株、硫杆菌1株、异养菌3株。
(3):通过 平板菌落观察、显微观察、革兰氏染色、DNA 提取和16 sr DNA PCR 初步 对铁杆菌A6进行鉴定
(4):对铁杆菌A6的生长因子：温度、初始pH、接种量进行研究发现最佳生长温度为35℃ 最佳pH为2.3 最合理的接种量为10%
(5):对硫杆菌B1不同底物的氧化情况进行分析，发现最适合B1的底物为Na2S2O3其次为单质S。
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