高磷软锰矿脱磷菌的选育及脱磷试验研究

我国锰矿中磷的含量普遍偏高，磷锰比［ω（P）/ω（Mn）］平均在0.1左右，而冶金用矿石要求ω（P）/ω（Mn）＜0.003。在已勘探的矿床中，含磷偏高［ω（P）/ω（Mn）＞0.005］的锰矿石占总储量的49.59%。锰矿石中的磷主要以磷灰石或胶磷矿形式存在。磷矿物粒度微细，或与能矿物紧密共生，或呈类质同象形式存在，单体分离较高困难。

近年来，国内外对锰矿石脱在户外工艺都进行了较为深入的研究。研究方法主要有高梯度磁选法、氨浸法、炉外脱磷法、黑锰矿法等。高梯度磁选法存在动力消耗过高、设备磨损严重、细微颗粒自动团聚等问题，按浸法仍停留在小试阶段；炉外脱磷法成本过高；黑锰矿法存在设备腐蚀严重等问题，都未能从根本上解决富锰降磷问题，所以研究者们提出了利用微生物脱磷新思路，并取得了较大进展。微生物技术的优点在于投资少、能耗小、成本低并对环境友好。研究表明，很多种细菌、真菌、放线菌都具有溶磷效果。不少研究者在实验室对磷矿粉浸磷都取得了成功。

本试验所用菌株为湘潭锰矿矿区不同植物根系土壤样品中筛选出的脱磷效果较好的菌株，通过紫外诱变得到高产菌株，并以此进行软锰矿脱磷试验，得到了较好的效果。

一、实验材料与方法

(一)土壤采集与预处理

所用土样取自湖南湘潭锰矿矿区植物根系表面以15～20cm深处，置于事先已灭菌的锥形瓶中，24h内分离菌株。

（二）矿样

矿样取自湖南永州市某锰矿、破碎，研磨至粒度小于0.1mm。矿样中ω（P）/ω（Mn）＝0.0109，属高磷锰矿。矿样多元素化学分析结果见表1。

表1  矿样多元素化学分析结果

（三）培养基

培养基除查氏固体培养基、牛内膏蛋白胨培养基和PKO固体培养基外，还酸制了富磷培养基（蔗糖30g，硝酸钠2～3g，磷酸氢二钾1g，硫酸严铁0.01g，氯化钾0.5g，硫酸锰0.5g,蒸馏水1000mL）和缺磷＋Cas(PO₄)₂培养基（葡萄糖10g，氯化钙0.2g，硫酸镁0.5g，硫酸铵2.0g，氯化钾0.2g，磷酸三钙0.9g，蒸馏水1000mL）。以上培养基均调整pH至7.0。

（四）试验方法

1、菌株分离

采用稀释平板分离法分离菌株，培养基为本氏培养基和年肉膏蛋白胨培养基。将所取土样制成10^－3，10^－4，10^－5，10^－6，10^－7各种浓度的稀释液。将10^－5～10^－7稀释度的溶液接种到培养基上，放入恒温生化培养箱中于30℃下培养。

2、溶磷菌的筛选

筛选分为平板初筛和摇瓶筛2个步骤。

初筛采用溶磷圈法。将分离获得的纯菌株接种于PKO固体培养基上，置于30℃培养箱中培7～15d，观察有无溶磷圈，并根据溶磷圈直径（D）与菌落直径（d）的比值初步确定脱磷能力。将有脱磷作用的分离物接种于斜面培养基上保存备用。

复筛时用无菌水将试管斜面上的孢子洗下，用血小球计数板计数，调整菌液浓度大概到10⁸个/mL。移取1mL该菌悬液接种于PKO液体培养基中，放在转速为150r/min的摇床上，于28℃下培养5d。将所得菌液于9000r/min离心机中分离15min，吸取上清液，用钼锑抗分光光度法测定其有效磷含量。

3、模拟锰矿脱磷

将试验用菌种接种至查氏周体培养基中，再转接种至富磷培养基中，放入摇床内，在30℃、150r/min转速条件下活化2次，每次2d，备用。

取活化后的菌种1mL接种至装有100mL含0.090g磷酸钙及0.2612gMnO₂(MnO₂)的量根据ω（P）/ω（Mn）＝0.0109计算所得）的缺磷培养基的三角烧瓶中，在30℃下，于150r/min转速摇床中好氧培养，考察pH和磷浓度的变化。

4、紫外诱变

以模拟锰矿脱磷试验中效果最好的P69号菌株为发菌株。

（1）菌悬液的制备。将P69菌株活化后用适量生理盐水洗下菌苔，倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡将菌块打破后，离心（3000r/min）20min，弃去上层清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整菌液浓度至10⁸个/mL。

（2）紫外线处理。打开15W紫外灯开关，预热20min。在无菌条件下，用移液管移取6ml上述菌悬液，放入9cm的无菌培养皿中，再放入一无菌磁力搅拌棒，然后置于紫外灯下30cm处，照射时间分别为2，4，6min。

在红灯下，将处理过的菌悬液稀释至10^－5，10^－6，10^－7，涂布在PKO无机磷培养基上，每种浓度的菌液涂3个平板，同时取未经紫外线处理的稀释菌液涂于平板上作对照。用报纸包好，避免光照，置于恒温培养箱中于28℃下培养48h。

（3）筛选。诱变菌株的筛选（初筛和复筛）方法与1.4.2相同。

5、软锰矿脱磷

取诱变后的P－2－8菌液30mL接种至装有150mL软锰矿矿浆缺磷培养基的三角烧瓶中（矿将固体质量分数为20%），基他方法同3。

二、结果与讨论

（一）平板初筛

在PKO固体培养基中于30℃培养箱中培养，得到具有明显溶磷圈的真菌菌株9株，其在7～15d内的D/d范围见表2，菌落特征见表3。

表2  9株脱磷菌在固体培养基上D/d范围

表3  9株菌菌落特征

（二）摇瓶复筛

接种1mL浓度为10⁸个/mL的菌悬液于PKO液体培养基中，放在转速为150r/min的摇床上，于28℃下培养5d。结果见表4。

表4  液体培养结果

初筛和复筛结果表明，P69的D/d值范围为1.12～2.30，在液体培养基中溶磷增加量为15.012mg/L，两个数值在9株溶磷菌中均为最大，因此P69具有最大脱磷能力。

（三）模拟锰矿脱磷

各菌株培养5d和10d后的pH值如图1所示，溶磷效果如果图2所示。

图1  不同溶磷菌株对溶液pH值的影响

         图2  不同菌株的溶磷效果

从图1，2可知，所有参试菌株培养5d后，培养pH均有所降低，至培养10d时，P71，P79，P98，P113，P115培养液的pH有一定回升，P69，P79，P95培养液Pha在本不变，P117的pH下降。培养5d时，菌株对P的脱降率达到50%左右，其中P69的脱磷率最高，为52.2%。

（四）此外诱变

 1、初筛

对P69进行紫外线诱变，共长出菌株29株，其中以P－2－8（诱变2min组的8号菌）的溶磷效果最好。诱变15d后，它的D/d值从1.12～2.30增大到1.47～4.33，与原菌株的对比情况如图3所示。

图3  固体培养基上D/d变化对比

由图3可见，从第6d起，诱变后菌株的D/d值明显提高，P－2－8的D/d值最高，达4.33。

2、复筛

对诱变菌株磷含量进行测定，其诱变后的脱磷菌的液体培养结果见表5。

表5  诱变后的脱磷菌的液体培养结果对比

由表5可见，诱变后，菌株的溶磷量为24.05mg/100mL，显著大于出发菌株P69的溶磷量（15.01mg/100mL）。诱变菌株溶磷量比出发菌株溶磷量提高约60.2%。

（五）软锰矿脱磷

图4为P－2－8和P69对软锰矿脱磷的试验结果。可以看出，P－2－8的脱磷率随着时间的延长而不断提高，从第3d的12.3%增加到第15d的74.6%，是原菌株P69脱磷率33.2%的2.25倍。脱磷后锰矿中磷的质量分数由0.19%下降到0.048%，ω（P）/ω（Mn）由原来的0.0109降至0.0028，脱磷后的矿石达到冶金要求。

三、结论

（一）从湘潭锰矿矿区所取土样中共筛选得到有溶磷效果的菌株9株。以这9株菌进行模拟锰矿脱磷试验，其中P69的脱磷效果最佳，脱磷率为52.2%。

（二）以P69号菌株为出发菌株进行紫外诱变，得到脱磷效果明显提高的菌株P－2－8。用P－2－8进行软锰矿脱磷试验，脱磷率为74.6%，脱磷后锰矿中磷的质量分数为0.048%，ω（P）/ω（Mn）为0.0028，符合冶金要求。