铝土矿的细菌浸出及微生物代谢产物试验研究

    据报道，不同种类的硅酸盐细菌能把作为杂质的硅从含有铝硅酸盐的低品位的铝土矿中分离出来，与传统方法相比，此法处理的铝土矿的特点是铝硅比更高，这样可适合用拜尔法来分离铝。     硅酸盐细菌的特点是它们在生长过程中需要硅。曾有报道，这些细菌对铝硅酸盐的作用具有酶的特征，它们能利用细菌分解矿物中硅所释放的能量。硅酸盐细菌为典型的异样细菌，这些细菌的分类还为固定，不同的研究者分离出了大量的此类细菌，它们多属于不同种类的杆菌，现国际公认的硅酸盐细菌为环状芽孢杆菌，我国及前苏联学者认为胶质芽孢杆菌也应归属于硅酸盐细菌类。      硅酸盐细菌分解铝硅酸盐矿物的机理目前说法不一，有关此方面的研究很少。本研究的目的在于说明“硅酸盐细菌”分解铝硅酸盐矿物很大程度上与处理方法密切相关；本文的另一主要目的在于说明“硅酸盐细菌”分解铝硅酸盐矿物很大程度上与处理方法密切相关；本文的另一主要目的在于说明细菌的不同培养环境，其分解代谢物的能力不同，这可能也是影响细菌浸出硅酸盐矿物效果的原因之一。     一、材料和方法     （一）材料      试验中使用五种硅酸盐矿矿样：1号矿样（铝土矿原矿样，由北京矿冶研究总院提供）；2、3、4、5号矿样分别为—水硬铝石与高岭石、正长石、绿泥石、石英按照5：1比例配制的人工混合矿样，各矿样中的氧化铝与二氧化硅的含量见表1。      试验使用了五种不同来源的硅酸盐菌种，这些菌种中三种硅酸盐细菌（JXF—1、JXF—2、JXF—3）是从所购硅酸盐菌肥（江西农业科学院微生物研究所赠）中分离筛选得到，均与胶质芽孢杆菌有关；另外两种中一种为模式环状牙孢菌B.C，一种为模式胶质牙孢杆菌B.M，是从中科院微生物所购得，由作者所在实验室驯化培养并保存。 表1  五种试验矿样浸出前Al₂O₃、SiO₂的含量（质量分数）

矿样	Al2O3/%	SiO2/%	Al/Si
12345	68.0672.2572.1568.9868.23	12.2812.3411.4512.5518.28	6.296.647.156.243.64

 表2  五种试验矿样中主要矿物类型及组成

矿样	矿物名/组成（%）
12345	—水硬铝石/65.2—水硬铝石/75.4—水硬铝石/78.4—水硬铝石/76.5—水硬铝石/79.3	高岭石/14.1高岭石/12.8正长石/14.3绿泥石/15.3石英/14.2	石英/4.5勃母石/3.2勃母石/5.9高岭石/4.3高岭石/4.1	氧化铁/2.3

      上述所有菌种都保存在阿什么基质矿物盐培养基中，其中含有2%的蔗糖作为细菌生长繁值碳和能量的来源。培养基组成为：蔗糖10g，K₂HPO₄  0.2g，MgSO₄·7H₂O  0.2g，FeCl₃  0.005g，CaCO₃  0.1g，铝土矿0.2g，琼脂0.1g，水1000ml，pH7.2。121℃灭菌2h。活细菌计数采用平板计数法进行测定。     （二）方法     1、硅酸盐矿物细菌浸出方法      通过5种不同的方式，利用这些菌种从试验矿样中浸出硅：（1）利用预先含被浸矿石的蔗糖培养基中培养菌种，在有糖培养基中进行硅的浸出；（2）利用预选在没有铝硅酸盐矿物的蔗糖培养基中培养的菌种，而在无糖培养基中进行硅的浸出；（3）利用预先含被浸矿石的蔗糖培养基中培养菌种，在无糖培养基中进行硅的浸出；（4）利用预先在没有铝酸盐矿物的蔗糖培养基中培养的菌种，而在有糖培养基中进行硅的浸出；（5）对照灭活菌种的浸出（浸出培养液中含蔗糖）。      浸出试验是在1L的锥型瓶中进行的，每个瓶中装有250ml阿什经基质矿物盐培养基、30g铝硅酸盐矿样（-38µm）和30ml活性细菌培养液，其中每毫升含4.5×10⁸个细胞。     对照灭活菌种的浸出形式与上相同，只是将含有活菌种的菌液在高温120℃下灭菌1.5h。上述五种细菌浸出的条件均为：浸出悬浮液pH值7.5，摇瓶转速240r/min,在培养温度35℃下连续培养7d。     在所有试验中，浸出结束后，从液相中分离出固体浸渣并用70℃弱碱性溶液冲洗，将液相过滤，固体浸渣再加到最初的渣中，对总的浸渣矿物粉末进行硅和铝的含量分析。试样首先经过碱熔法溶解，然后用钼酸盐蓝比色法测定硅的含量，铝用原子吸收光谱仪测定，浸出液样品中的硅的测定方法按文献中的方法进行。      2、有机酸、氨基酸、多糖分析      四个500ml锥型瓶分别装150ml培养基Ⅰ（含铝土矿粉10g的阿什比基质矿物盐培养基）、Ⅱ（不含铝土矿粉的阿什比基质矿物盐培养基）、Ⅲ（含铝土矿粉10g但不含蔗糖的阿什比基质矿物盐培养基），Ⅳ（不含铝土矿粉也不含蔗糖的阿什比基质矿物盐培养基），120℃灭菌2h，冷却后将硅酸盐细菌悬浮液按2%接种量接入锥型瓶中，36℃振荡培养（200r/min），培养时间为0、6、12、24、36、48、72、96h后分析。           有机酸的测定：分酵液中的有机酸采用酸硫酸提取法，用高效液相色谱测定各种有机酸的含量。具体测定由本实验室专业老师进行。      氨基酸的测定：发酵液先用三氨醋酸法处理，用0.015mol/L盐酸稀释后用氨基酸分析仪测定。三种培养基发酵液中的多糖测定：在提取有机酸后的发酵液中，加入乙醇离心分离，获得粗多糖，60℃烘干，称重粗多糖。      3、硅酸盐细菌代谢产物浸溶高岭石的分析      利用各种硅酸盐细菌代谢产物浸出硅酸盐矿物——高岭石（纯度86%，由本实验分离提纯，原矿样取自郑州铝厂），采用摇瓶浸出的方法，具体实施在结果分析中分别进行了说明。浸出液中硅采用硅钼蓝分光光度法测定。      二、结果分析      （一）在五种不同的细菌浸出方式下矿样的细菌浸出结果讨论       试验菌种采用JXF—1。试验中发现，硅的浸出程度与浸出方式密切相关。用欲浸矿样加蔗糖培养菌种的浸出与预先在不含矿样的蔗糖中培养菌种，在无糖介质中的浸出相比，前者效果更好。说明在预先有被浸矿样的环境中培养的菌种适应性强，细菌在浸出过程中停滞期短，细菌繁殖速度较快。浸出结果见表3。 表3  浸出方式对铝硅酸盐矿样除硅效果的影响（7天内浸出的硅）/%

浸出                     方式      矿样	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
12345	50.460.425.765.3051.23	30.8035.8112.2042.3532.56	41.2050.2318.2356.7042.10	38.2045.3015.9049.6035.70	6.527.832.5610.204.53

      在既无含有铝硅酸盐矿样又含蔗糖的烧瓶中，即浸出方式（1），浸出开始，细菌出现强烈繁殖，细菌数量超过8×10⁸/ml。但在7d浸出期结束时，所有细菌菌种或者处于静止状态，或者处于生长萎缩阶段，尽管如此，有生存力的细菌量仍高于10⁸个/ml，培养液最终的pH值在5.5～6.5。      在含矿样但不含蔗糖的烧瓶中，即浸出方式（2），浸出开始，细菌数量有一不定期的降低，细菌繁殖存在一个停滞期，最终从4.5×10⁸上/ml增加到不足8×10⁸个/ml。此初始繁殖阶段可能与细菌利用了储备的物质和随细菌悬浮液带进烧瓶的物质。随后，细菌出现溶解，数量下降，7d浸出结束时，烧瓶中每毫升只有不足10⁷个细菌，培养液最终的pH值在6.8～7.3之间。      浸出结束后，对浸出方式（1）中的固体浸渣进行了矿物组成成分分析，结果见表4。结果表明铝硅酸盐矿物是细菌作用的主要对象。绿泥石比高岭石等其它矿物更容易浸出，说明细菌对不同结构的铝硅酸盐矿物的浸出能力不相同，这可能是由于硅在各种矿物中的赋存状态的差异所致。 表4  五种试验矿样细菌浸渣中主要矿物类型及组成

矿样	矿物名/组成（%）
12345	—水硬铝石/75.2—水硬铝石/81.3—水硬铝石/82.4—水硬铝石/91.2—水硬铝石/87.7	高岭石/14.0高岭石/7.5正长石/10.2绿泥石/5.8石英/8.1	石英/5.6勃母石/4.3勃母石/6.2高岭石/7.2高岭石/5.3	氧化铁/3.2

     （二）五种不同来源硅酸盐细菌对矿样的浸硅能力试验结果      试验采用第一种细菌浸出方式，分别对2号矿样和4号矿样进行细菌浸硅研究，结果见表5。结果表明，不同来源的硅酸盐细菌均能较好地从铝硅酸盐矿物中浸出硅，但它们的浸出能力存在较明显的差异。总的来看，胶质芽孢杆菌类细菌的浸出硅的能力要比环状芽孢杆菌浸出硅的能力强，这可能与胶质芽孢杆菌分解胞外多糖及有机酸等代谢产物的能力要强于环状芽孢杆菌有关。 表5  各种硅酸盐细菌对矿样中硅的浸出结果（7天内浸出硅的量）/%

微生物	1号铝硅酸盐矿样	4号铝硅酸盐矿样
环状牙孢杆菌类B.C胶质芽孢杆菌类JXF-1JXF-2JXF-3B.M	35.30 50.442.337.240.5	48.20 65.361.257.351.2

      （三）细菌在不同生长环境中分解代谢产物的测定结果     不同的细菌浸出方式，细菌浸出硅酸盐矿物中硅的效果不同，导致这一结果的主要原因可能与细菌生长繁殖的环境密切相关。前面一（二）的前四种浸出方式的差别实质是在四种不同的发酵培养基中，产生了四种不同浸出能力的硅酸盐细菌。试验测定了细菌在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种不同培养基中振荡培养48h后发酵液中的有机酸、荚膜多糖的含量，结果见表6。 表6  在不同培养基中细菌发酵48h合成的代谢产物含量

培养基	培养48h代谢产物含量/(mg·ml-1)
	有机酸	氨基酸	荚膜多糖
ⅠⅡⅢⅣ	0.410.250.380.05	0.1300.1090.0850.023	7.506.302.301.25

     表6的有机酸量是细菌产生的四种有机酸（草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸）的总和，而氨基酸的量为细菌产生的各种氨基酸的总和。从表6结果可以看出，细菌在增养基Ⅰ中发酵培养时产生的有机酸、氨基酸、荚膜多糖量最多，而用此功菌浸出矿样中硅的效果也最好。这可能与有机酸、多糖能和硅酸盐矿物中的硅等形成络合物，促使金属从矿物晶格中分离出来有关。试验中对细菌发酵液中的氨基酸进行了测定。      （四）有机酸、氨基酸、多糖协同作用对高岭石的浸溶效果     试验中在500ml的锥型瓶中各代谢物及试验矿物的组成——混合有机酸的组成：各取浓度为200mg/L的四种有机酸（草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸）；混合氨酸的组成：取最大浓度的每种氨基酸混合组成；多糖浓度为8.5g/L；高岭石15g/L。      有机酸、氨基酸、多糖在浸出硅酸盐矿物中硅、铝的能力上有明显的作用，试验结果见表7。由表7结果可以看出，各代谢产物分解高岭石的能力为：混合的有机酸＞混合氨基酸＞多糖。氨基酸、有机酸、多糖三者混合物溶解高岭石的能力比单独代谢产物的溶解能力大大地增加。另外，细菌的代谢产物浸出高岭石中硅、铝能力与其结构有关，用双氧水破坏代谢物的结构，它们活化高岭石的能力大大降低。同时，硅酸盐细菌的代谢产物对高岭石的活化离要是通过具有络合基团的有机物的络合作用，各代谢产物具有与矿物中各种金属特别是铝、硅等形成络合物的有机基团如—COOH、—NH₂或—COO^―、―NH^＋₄，它们均对金属离子具有一定的络合能力。从表中结果可以制裁出，0.001mol的硝酸溶解高岭石的铝、硅能力远低于各种混合代谢物作用于高岭石的能力，原因就是各种混合代谢产物具有络合硅酸盐矿物中各种金属离子的能力，从而破坏矿物的晶格结约，释放出各种金属元素。 表7  硅酸盐细菌代谢产物对高岭石的硅、铝的浸出

代谢产物	上清液中SiO2/(mg·L-1)	上清液中Al2O3/(mg·L-1)
混合有机酸      混合有机酸+H2O2      混合氨基酸      混合氨基酸+H2O2      多糖      多糖+H2O2      混合有机酸+氨基酸+多糖      混合有机酸+氨基酸+多糖+H2O2      多糖+混合有机酸      多糖+混合有机酸+H2O2      多糖+混合氨基酸      多糖+混合氨基酸+H2O2      混合氨基酸+混合有机酸      混合氨基酸+混合有机酸+H2O2      蒸馏水      0.01mol硝酸	120.835.4098.4032.2029.7010.25352.2656.70144.5052.4098.1035.25187.726.755.2036.40	54.2012.4048.756.769.803.2167.5815.2050.209.2258.4312.2562.1212.204.7033.21

     三、结语       （一）试验表明，硅酸盐矿物中硅的细菌浸出效果与细菌浸出方式密切相关，不同的细菌浸出形式，细菌浸出硅的能力有较大的差异。利用在预先含有被浸矿样的蔗糖中培养的菌种，并在有糖介质培养基中进行硅的浸出时，其浸出硅的能力最强。原因可能是，细菌在此培养基中进行硅的浸出，由于细菌已适应被浸矿样环境，其生长繁殖不要经过停滞期；同时，细菌可以利用培养基中的蔗糖作为自身生长繁殖的营养物质，使细菌不致于浸出过程中由于自身的溶解而使细菌数量有较大幅度的下降，从而保证了矿样浸出中所必段的微生物数量。       （二）不同硅酸盐矿物晶格结枸，细菌浸出其硅的能力不同。绿泥石属层状结构的硅酸盐矿物，细菌浸出其硅的效果最为明显，而石英、长石为架状结的硅酸盐矿物其硅氧四面体相互结合的键力强、物质性能稳定，这是导致细菌浸出其硅的效果较差的可能原因之一。       （三）试验结果表明，细菌在不同的培养基中合成各种代谢产物的能力有一定的差别，硅酸盐细菌在各种培养基中可以合成草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸等四种主要的有机酸和各种多糖及各种氨基酸，在含被浸矿样及蔗糖和各种多糖及各种按基酸，在含被浸矿样及蔗糖的阿什比基质的矿物盐培养基中产生的量及类型最多。     （四）试验表明，在矿样的活细菌浸出过程中，培养液的最终pH值较浸出初期都有一定程度的下降，说明细菌在浸出繁殖过程中能产生一定量的有机酸。有机酸与铝硅酸盐矿物中的硅、铝等金属可以形成络合物，从而促使其溶解到浸出液中。     （五）硅酸盐细菌代谢产物对高岭石的硅、铝的浸出试验表明，氨基酸、有机酸、多糖三者混合物溶解高岭石的能力比单独代谢产物的溶能力大大增加。另外，细菌的代谢产物浸出高岭石中硅、铝能力与其结构有关，用双氧水破坏代谢物的结构，它们活化高岭石的能力显著降低。原因就是各种混合代谢产物具有络合硅酸盐矿物中各种金属离子的能力，从而破坏矿物的晶格结构，释放出各种金属元素。 孙德四，张强（北京科技大学，北就100083；九江学院，江西  九江  332005）     参考文献      [1]GrondevaⅣ.铝土矿的微物物选矿[J]，国外金属矿山，1989，（11）：9-12。     [2]盛下放，黄为一，硅酸盐细菌DBT菌株生理特征的研究[J]，土壤学报，2001，35（4）：569-574。      [3]亚历山大罗夫著，叶维青译，矽酸盐细菌[M]，北京：科学出版社，1955：1-65。     [4]吴小琴，硅酸盐细菌的应用概况[J]，江西科学，1997，15（1）：6-65。     [5]廖延雄，傅筱冲，蔡汝林，等，一株硅酸盐细菌的表型特征[J]，江西科学，2000，18（3）：149-153。     [6]连宾，硅酸盐细菌解钾作用机理研究[M]，贵阳：贵州科学出版社，1998，77-153。     [7]施巧琴，吴松刚，工业微生物育种学[M]，北京：科学出版社，2003，256-400。     [8]格劳德夫SN，矿物原料的生物选矿[J]，国外金属矿选矿，200，（6）2-9。     [9]中国科学院南京土壤研究所微生物室，土壤微生物研究法[M]，北京：科学出版社，1985，51-57，154-162。     [10]盛下放，黄为一，殷永娴，硅酸盐菌剂的应用效果及其解钾作用的初步研究[J]，南京农业大学学报，200，23（1）：43-46。