黄铜矿与方铅矿的生物诱导分选

    一、概述

    利用微生物和相关的胞外生物聚合体从方铅矿与闪锌矿或黄铁矿的二元混合物中选择性分离方铅矿已有文献报道。本研究所用Paenibacillus poly－myxa菌（多黏芽胞杆菌，缩写为P.polymyxa菌）为革兰氏阳性细菌，嗜中性，周边生有鞭毛状异养生物，在许多矿床中生存。在P.polymyxa菌代谢的主要产物中除含有主要的生物聚合物，如胞外多糖和蛋白质之外，还含有有机酸，如草酸、甲酸和乙酸。

    除要对用生物来源的聚合物微生物诱导分选黄铜矿和方铅矿进行研究外，了解生物体本身对分选过程的影响也是需要的。已对细菌特效的亲合力和生物聚合物对附着行为的调整进行了研究。然而，仍然需要了解在矿物和细菌界面上存在的生物聚合物以及其在附着过程中所起的作用。本文将确定黄铜矿和方铅矿对胞外生物聚合物，如胞外蛋白质(EBP)和胞外多糖(ECP)的亲合力。还研究了与可浮性相关的表面疏水性与生物药剂吸附的变化关系。

    二、原料和试验方法

    （一）矿物

    样品采集自印度Indscer Fabriks的Almin－Rock，通过手选得到的高纯度黄铜矿和方铅矿样品。利用化学分析、X射线分析和矿物学分析来确定样品的纯度。黄铜矿和方铅矿样品纯度分别为99.8％和99.7％。用瓷球磨机将上述样品细磨，再筛分成－105＋74μm和－37μm粒级。－37μm粒级进一步球磨，通过沉降得到－5μm粒级。用Malvern Zetasizer粒度分析仪对样品进行粒度分析，其平均粒度为3～5μm。该粒级用来进行吸附和絮凝试验。使用BET氮吸附法测定样品的比表面积。通过上述方法得到的黄铜矿的比表面积为1.93m²／g。方铅矿为1.939m³／g。－105＋74μm粒级用来进行浮选研究。

    （二）细菌培养

    本研究所用P.polymyxa菌株（编号为NCIM2639）由印度国家化学实验室中的国家工业微生物标本室获得。在实验室使用Bromfield培养基进行培养。使用硝酸钾来维持离子强度，使用硝酸和氢氧化钾作为pH调整剂。试验中所有试剂均为分析纯级。试验中使用比电导率<1.5μS/m的二次蒸馏去离子水。将10 mL纯的菌株注入Bromfield培养基进行培养。在30℃，转速340r/min的Remi培养箱中进行培养。使用Systronics数字pH计每30min检测一次pH的变化。

    （三）制备无细胞代谢产物

    将在4℃下生长完全的细菌（48h）经SorvallRC－5B型离心机（10000 r/min）离心15 min。倾析出上清液，用无菌的Millipore（孔径o.2μm)过滤除去所有不可溶物质，同时除去细菌细胞。细胞球使用二次蒸馏去离子水洗涤，然后再离心。上述过程重复两次，以得到纯净的细胞球。

    （四）从代谢产物中分离出蛋白质

    经过48 h培养，取1LP. polymyxa菌培养液进行离心。上清液用Millipore（孔径0.2μm）滤纸过滤。在4℃衡定振荡下，缓慢加入分析纯超细颗粒状硫酸按，浓度为90％(600.16g/L)。溶液在4℃下冷却12h。蛋白质沉淀物溶解在1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲剂溶液(pH 7)中。在4℃下渗析18h。离心除去在渗析时产生的沉淀物。上清液冷冻，称重后在4℃下保存。

    （五）从代谢产物中分离出胞外多糖(ECP )

    取1L经48h培养液离心除去细胞。含有ECP的上清液用无菌Millipore膜过滤。然后使用Virtis Freezemobile 12EL冷冻机在－80℃，真空下冻干至200mL。在室温下将脱水的固体物质溶解于10mL蒸馏的millipore高纯水中，并冷却l0℃以下。加人20 mL二次蒸馏的乙醇来沉淀ECP，并将它与其它含有细菌的上清液分离出。重复上述乙醇沉淀两到三次，从而进一步提纯多糖。该多糖溶液用二次蒸馏水透析。在透析之前，透析管在0.01mol/L EDTA和2％的碳酸氢钠溶液中水浴沸腾10～15min。透析之后，ECP在低温下（4℃）保藏。ECP的纯度采用苯酚－硫酸法侧定。

    （六）吸附试验

    将1g矿物样品加入到放在250mL Erlenmeyer烧瓶中的已知pH和EBP浓度的100 mL10^－3mol/L KNO₃溶液中。在30℃和250 r/min下，使用Remi振荡器振荡15min。平衡之后，再次测定矿浆的pH。然后在200 r/min下离心5min，除去粘附有EBP的矿物颗粒。含有EBP的上清液用Whatman 42号滤纸进一步过滤，测定上清液中剩余的EBP浓度。采用类似的方法研究细菌细胞和ECP在矿物颗粒上的吸附行为。

    （七）絮凝研究

    在絮凝研究中将1g矿物样品分散于装在容积为100 mL的带有刻度的量筒中的100mL二次蒸馏去离子水中。将盖好塞子的量简上下倒置翻转10次，然后静置2min。使用移液管将90ml，上清液移出放入烧杯中。过滤上清液，烘干和称重，得到固体颗粒分散的质量分数。以pH和时间为变量进行试验。将含有1g的50 mL矿浆与50 mL蛋白质上清液或已知浓度的ECP加人100 mL带塞子的量筒中进行絮凝试验。在混合之前将矿浆和蛋白质的pH调整至同一数值。选择性絮凝试验用1∶1重量百分数的方铅矿和黄铜矿的二元混合物中进行。含有0.5g的50ml，添矿浆与50mL添细菌上清液一起加入带有刻度的量筒中。混合之前，将矿浆和细胞上清液的调到相同的pH。将带塞子的量筒翻转10次，静置2min（脱泥阶段）。分散和沉降产品进行ICP光谱分析，以得到每种矿物在两个产品中的质量分数。

    （八）微量浮选试验

    在中性pH下，将1g矿物与100 mL添含有已知浓度EBP、ECP或细菌细胞的二次蒸馏去离子水放在锥形烧瓶中混合。将烧瓶在250 r/min振荡器中孵化30min。作用之后将上清液除去，分离得到矿物颗粒．沉在底部的矿物颗粒用Whatman42号滤纸过滤后用二次蒸馏去离子水洗涤，除去矿物表面上粘附的EBP，ECP或细胞。将调整后的矿物转移至改进过的哈里蒙德浮选管中。通40 mL添／min氮气浮选3 min。分离沉降的和浮出的部分，分别烘干并称重。以异丙基黄原酸钾(PIPX)作为捕收剂，以研究浮选行为。同时研究了捕收剂和细菌试剂的添加顺序对浮选的影响。将1g较度为－105+74μm矿物(1∶1重量比）悬浮到200 mL添溶液中。浮选之前，将矿物混合物与不同的细菌作用。用磁力搅拌器将矿物混合样品与已知pH的溶液混合15～20min.然后进行浮选试验研究。浮出的矿物用ICP测定，然后计算回收率。

    （九）SEM分析

    在10000 r/min下离心分离15 min后得到细菌细胞。将细胞球再次悬浮在二次蒸馏去离子水中。用通过氮气的水清洗矿物颗粒两次．将0.5g矿物悬浮在50mL添含有氮气的水中(NW)。将上述得到的矿物颗粒与已知数量的细胞相互作用。在锥形烧瓶中作用，然后转移至Eppendorf管中，在5000r/min下离心分离。加入5％的戊二醛，刚好能够浸没矿物样品，在100 r/min下搅拌2h，然后与0.5％戊二醛再搅拌2h。再用35％的乙醇调节矿物样品。用微量移液管取出0.5 mL添，取一滴放到有盖的玻片上，在干操器中干操15min，然后加一滴(50％）乙醇。干操15min。然后用70％和95％的乙醇重复上述过程。完全干操后，用浓度依次为35％、50％、70％和95％的丙酮进行顺序干燥。将盖玻片保存在干燥器中，直到进行SEM测试（不应超过12 h)。

    三、结果与讨论

    （一）吸附研究

    首先建立了细菌细胞，EBP和ECP在方铅矿和黄铜矿表面上的吸附行为与作用时间和pH的变化关系。结果如图1和2所示。图1为细菌细胞在黄铜矿和方铅矿上粘附的扫描电镜照片。由图可以看出，细菌细胞对两种矿物的亲合力均比较大。通过测定不同组分在矿物表面上吸附密度随时间的变化得到了细菌细胞的吸附动力学曲线。在10^－3mol/L KNO₃，pH6.5～7下观察了吸附行为随时间的变化。在吸附之前，细胞浓度为4×109个细胞／mL。图2，a表明，作用15 min后细菌细胞在黄铜矿上的吸附密度为1.5×109个细胞／m²，而方铅矿上为1×109个细胞／m²。这表明细菌细胞在矿物上的吸附并没有选择性。文献表明，细胞壁含有多糖和蛋白质。因此，在EBP初始浓度为4mg/g矿物时研究了EBP的吸附行为。图2，a表明，作用15min后EBP在黄铜矿上的吸附密度为3 mg/m²，而方铅矿则低于1 mg／m²。同样在ECP初始浓度为10mg／g时，研究了ECP的吸附行为。图2，a表明，作用15 min后，超过9 mg/m²ECP吸附在黄铜矿上，而在方铅矿上的吸附量低于8mg／m²。在与两种矿物作用15min后，ECP便在矿物表面上饱和。然而，EBP和ECP在黄铜矿和方铅矿上的吸附量没有细菌细胞在这两种矿物表面上的吸附量那样大。

图1  在黄铜矿（a）和方铅矿（b）上的P. polymyxa，菌细胞的SEM照片     图2，b为细菌细胞，EBP和ECP在矿物上的吸附量随 pH的变化。在所有pH下，细菌细胞在黄银矿上的吸附密度都比在方铅矿上的大。在酸性范围内。黄铜矿上的吸附密度比方铅矿上的高。对于黄铜矿，随pH增加，细菌细胞吸附密度锐减。EBP在黄铜矿上的吸附密度在酸性pH范围内变化均匀，中性范围内为3 mg/m²；而对于方铅矿，在整个pH范围内，吸附量比较均匀，最大吸附密度为1mg/m²。ECP在黄铜矿上的吸附密度在pH为3～8时从4 mg/m²变化到8 mg/m²。对于方铅矿也观察到类似的行为。ECP在黄铜矿和方铅矿上在酸性pH范围内的吸附行为与碱性范围内的吸附行为类似。然而，EBP在酸性和碱性pH范围内在黄铜矿上的吸附量比在方铅矿上的要大。

图2  上图：在pH6.5～7时,P.polymyxa菌的细胞、ECP和EBP在黄铜矿和方铅矿上的吸附密度随时间变化（pH6.56.7）；下图：P. polymyxa菌的细胞、ECP和EBP在黄铜矿和方铅～矿上的  吸附密度随pH变化（作用15 min) ■－细菌细胞＋黄铜矿；●－细菌细胞＋方铅矿；□－ECP＋黄铜矿；○－ECP+方铅矿；△－EBP＋黄铜矿；△－EBP+方铅矿     （二）絮凝试验     确定了不同生物试剂和细菌细胞存在下，不同时间和pH时黄铜矿和方铅矿细粒的沉降行为．图3为黄铜矿和方铅矿随时间变化的沉降行为。图3，a表明在pH为6.5～7时，在作用15min后，黄铜矿从没有细菌细胞时的沉降率30％增加至有细菌细胞时的90％。细菌细胞壁含有多糖和蛋白质。因此，研究了在有EBP和ECP存在时矿物的絮凝率随作用时间的变化。在用EBP作用黄铜矿15min时絮凝率为95％；而有ECP存在时，则只有很少的黄铜矿发生絮凝。细菌细胞和EBP的作用促使大量的细粒黄铜矿絮凝，在只有ECP存在时，细粒黄铜矿的絮凝没有明显变化（图3，b和c）。15 min方铅矿的沉降率从没有细胞存在时的35％增加至有细胞存在时90％。然而，在EBP时，15 min方铅矿的沉降率降至20％以下，而不加任何药剂时的沉降率为30％。方铅矿与ECP作用后15min的絮凝率高于90％，而没有任何试剂时絮凝率为35％。细菌细胞和生物试剂的特效性归因于矿物与细菌细胞壁上的特效官能团。在分别测试黄铜矿和方铅矿絮凝效果时，每一种矿物都沉降15 min。与EBP作用时，黄铜矿的沉降速率(15 min内为95％）比方铅矿高沉降率(15min内为20％）高。与ECP相互作用后，约30％的黄铜矿和高于90％的方铅矿在15 min内发生沉降。矿物与细菌细胞、EBP和ECP在不同PH下的沉降行为如图4所示。图4，a表明，在没有任何药荆时，90％的黄铜矿在PH³时沉降，而在PH 9时沉降率减少至40％。在pH3～9且有细菌细胞和EBP存在时，大约90％的黄铜矿沉降。方铅矿在没有任何药剂和pH3时的沉降率为55％，pH9时沉降率为35％。

 图3   黄铜矿和方铅矿在有细菌胞（上）、ESP（中）和ECP（下）存在时的沉降与沉降时间的关系   1－黄铜矿；2－方铅矿；3－黄铜矿＋细菌细胞；4－方铅矿＋细  菌细胞；5－黄铜矿＋EBP；6－方铅矿＋EBP；7－黄铜矿＋ECP； 8一方铅矿＋ECP  图4 黄铜矿和方铅矿在有细菌细胞（上）、EBP（中）和ECP（下）存在时的沉降与pH的关系   1－黄铜矿；2－方铅矿；3－黄铜矿＋细菌细胞；4－方铅矿＋细菌细胞；5－黄铜矿＋EBP；6－方铅矿＋EBP；7－黄铜矿＋ECP；8－方铅矿＋ECP     然而，在有细菌细胞存在时，矿粒的沉降率增加。几乎90％的方铅矿在与细菌细胞作用后发生沉降。图4，b表明，在没有药荆和pH3时黄桐矿的沉降率为90％，而在pH9时其沉降率下降至40％。在有EBP存在和pH3时，黄铜矿沉降率为92％，pH7沉降率为95％，pH9时沉降率降至65％；而在没有药剂和pH3时方铅矿的沉降率为55％，pH9沉降率为35％。然而，方铅矿在pH3范围沉降率为30％，在pH 9降至20％。这表明方铅矿在有EBP时得到分散。图4，c表明，在没有任何药剂存在和pH3时黄铜矿的沉降率为90％，pH9时沉降率降至40％．然而，有ECP存在时，黄铜矿的沉降率很小，这表明ECP没有大的影响。没有任何药剂和pH 3时方铅矿的沉降率为55％，pH9时沉降率降至35％。然而，在有ECP存在时，方铅矿絮凝显著增加。在pH 3～9范围内95％以上方铅矿絮凝。     细菌细胞／生物试剂与矿物形成的絮团是三维圆盘．絮状物的SEM照片表明，细菌细胞与矿物混合在一起，并且相互包裹。早期研究结果表明，细胞表面组织对不同矿物有特定的亲合力。因此，细菌细胞壁作为矿物与细菌细胞的桥梁将它们连接为三维结构．SEM絮团如图5和6所示。由细菌产生的生物试剂(EBP)同样也形成矿物絮团。

图5  矿物与细菌细胞形成的絮团的SEM照片和示意图

      图6  矿物与胞外产物形成的絮团的SEM照片和示意图     （三）选择性絮凝研究     对用细菌细胞，EBP和ECP从黄铜矿和方铅矿二元混合物中选择性分离方铅矿进行了试验。从表1结果可以看出，在有细菌细胞存在时可以分离出71.4％的方铅矿，在有EBP存在时，可以分离出92.3％的方铅矿。在pH 8.5～9时，有细菌细胞存在时可以分离出70.2％的方铅矿，在有EBP存在时，可分离出89.7％的方铅矿。 表1  在有细菌细胞（5×108个细胞/mL）和P. Polreyxa 菌的EBP（50mg/g）存在时，从黄铜矿和方铅矿混合物（质量比1∶1）中选择性絮凝黄铜矿

脱泥段编号（每段3min）	不同pH时方铅矿去除（累积）/％
	6.5～7		8.5～9
	细胞	EBP	细胞	EBP
12345	22.641.861.868.071.4	25.649.769.981.292.3	31.256.762.369.870.2	33.045.670.285.189.7

     图4，c结果表明，ECP并不能显著影响黄铜矿的沉降率。同样观察了在与ECP作用后从黄铜矿和方铅矿二元混合物中分离方铅矿的情况。表2表明，在pH 6.5～7范围，可分离出87.2％黄铜矿，在pH 8～8.5范围可分离81％黄铜矿。 表2  在有从P. polymyxa，菌上清液中分离出的ECP（l00mg/g）存在时，从黄铜矿和方铅矿（质量比1∶1）混合物中选择性絮凝黄铜矿

脱泥段编号（每段2min）	不同pH时黄铜矿去除率（累积）/％
	6.5～7	8～8.5
12345	40.162.371.982.387.2	35.059.768.779.681.0

     （四）微量浮选试验     也研究了与细菌细胞、EBP和ECP作用后的黄铜矿和方铅矿的浮选行为。确定了在有捕收剂，例如PIPX存在时与EBP和ECP作用后的矿物浮选行为。从图7可以看出，与细菌细胞、EBP和ECP作用后，黄铜矿的浮选回收率为20％。然而，与EBP作用后，方铅矿表现出疏水行为。在pH3，方铅矿的浮选回收率由25％增至与EBP作用后的45％。在pH 6时浮选回收率为65％pH 9降至45％。然而，与细菌细胞和ECP作用后，方铅矿的回收率降低。

图7  不同pH下与细菌细胞、ECP作用后的黄铜矿（上）和方铅矿（下）的浮选回收率 □－不与药剂作用；●－与细菌细胞作用；▲－与EBP作用；▲－与ECP作用     （五）微量分离浮选试验     在研究过经不同生物试剂处理过的单矿物浮选行为之后，又研究了用不同生物试剂从黄铜矿和方铅矿二元混合物中分离黄铜矿的可能性。为了提高分离效率，添加异丙基黄原酸钾(PIPX)。表3为采用细菌细胞，EBP和ECP时，选择性浮选分离试验结果。从表3可以看出，与细菌细胞作用后，经PIPX（1×10^－3mol/L）调整后，混合物中黄铜矿的回收率为49.9％，方铅矿的回收率为44％。当PIPX浓度降至5×10^－4mol/L时，黄铜矿的回收率为44.4％，方铅矿回收率为37.2％。然而，当混合物先与PIPX(1×10^－3mil/L)作用，然后再与细菌细胞作用，则黄铜矿的回收率为48％，方铅矿的回收率为47.9％.当PIPX浓度降至5×10^－4mol/L时，黄铜矿的回收率为39.2％，方铅矿的回收率为38.8％．当混合物先与EBP作用，然后与PIPX (5×10^－4mol/L）调节，黄铜矿的回收率为29.1％，方铅矿为81.4％。然而，与ECP作用后，黄铜矿的浮选回收率为49.6％，方铅矿回收率为14.1％。 表3  在pH6～6.5，用PIPX为捕收剂，用细菌细胞、EBP和ECP处理后，黄铜矿和方铅矿的分离浮选结果

试验条件	细胞/生物试剂浓度	PIPX浓度/mol·L－1	黄铜矿回收率/％	方铅矿回收率/％
先与细胞作用，然后用PIPX处理	2×109个细胞/mL	1×10－3	49.9	44
先与细包作用，然后用PIPX处理		5×10－4	44.4	37.2
先与PIPX作用，然后细胞处理	2×109细胞/mL	1×10－3	48	47.9
先与PIPX作用，然后细胞处理		5×10－4	39.2	38.8
先与EBP作用，然后用PIPX处理	50mg/g	5×10－4	29.1	81.4
先与EBP作用，然后用PIPX处理	100mg/g	5×10－4	49.6	14.1

     四、结论

    由本试验结果可得到如下主要结论

    （一）Paenibacillus polymyxa菌细胞可以强烈地吸附在黄铜矿和方铅矿表面上。

    （二）)然而，细菌胞外产物，如生物蛋白质和外胞多糖，在黄铜矿上的吸附量高于方铅矿。

    （三）与细菌作用后黄铜矿和方铅矿的絮凝程度增强。与生物蛋白质作用后促进黄铜矿絮凝，然而外胞多糖可增强方铅矿的絮凝。

    （四）在pH高于6时，生物蛋白质增强方铅矿的浮选。

    （五）在自然pH下，通过控制生物蛋白质和外胞多糖的调节的生物诱导絮凝可以使方铅矿与黄铜矿有效地分离。相似地，先与生物蛋白质作用可以增强方铅矿从黄铜矿中的选择性浮选。