植物树叶总蛋白组织样品处理方法
对多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言,同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出两种提取植物树叶总蛋白程序:
裂解液制备:
(A),7M Urea,2M Thiourea,4%(w/v)CHAPS,40mM Tris-base,40mM DTT,2%Pharmalyte pH3-10.
(B),905M Urea, 2%(w/v)CHAPS, 0.8%(w/v)Pharmalyte pH3-10,1%(w/v)DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;
三氯醋酸-苯酮沉淀法提取植物树叶总蛋白程序:
- 先将植物树叶置于液氮中速冻,后放置于Gd200组织研磨仪中研碎;
- 悬浮于含10%三氯醋酸和0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液,-20℃冰浴;
- 让蛋白质沉淀过夜然后离心(4℃,40,000g,1h),弃上清液;
- 重悬沉淀浮于含0.07% β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里;
- 离心(4℃,40,000g,1h)后真空干燥沉淀;
- 用(A)或(B)裂解溶液溶解沉淀,离心(4℃,40,000g,1h);
- Brandford法定量蛋白,然后分装保存在-78℃备用
超速离心法:
- 取材;
- 用Gd200组织研磨仪在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液,使用Gd200高通量组织研磨仪研磨匀浆30s;
- 组织悬液15℃,10,000×g离心10min;
- 上清液4℃,150,000×g超速离心45min;
- 小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;
- 取离心上清。Brandford法定量蛋白,分装后置-75℃保存。