组化笔的实验原理与意义

    组化笔又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、 组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、 电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。    自制组化笔在免疫组化染色中的应用戴晓淳，组化笔在免疫组化染色中，为防止抗体外溢和被稀释，必须擦掉切片组织周边的液体，耗时费力。采用Ｓ—Ｐ法免疫组化染色的切片经二甲苯脱蜡、纯酒精脱苯后，用自制组化笔在切片组织周围画一圆圈，再逐级水化，以后染色步骤按试剂盒说明进行。目前，国外生产的组化笔，价格贵，国内尚未生产。用自制的组化笔经标记后，每步只需甩掉液体后直接滴加抗体进行染色，此时滴加的抗体被限定在组化笔所划好的范围内，无外流现象。本法每张切片平均滴加抗体２０～３０ｍｌ，明显节省了抗体，染色结果与擦片法比较也无明显差别，此油性圈在组化染色完成后，经酒精逐级脱水、二甲苯透明后即可去除。将液体灌入废弃的ＭＡＲＫＥＲ笔或水彩笔，即成组化笔。    细胞通透、封闭内源性过氧化物酶，用封闭通透液浸润切片30min（RT 避光）配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加 400 ul 30％H 2 O 2 。PBS 溶液洗 3 次×3 min。抗原修复暴露抗原决定族 10) 切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4min至沸腾后，再加热约 6 min×4 次， 每次间隔补足液体， 防止干片。封闭非特异性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min； 12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈, 在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中，室温30（10～30）min。一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入 已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需 37 ℃复温 45 min。二抗孵育。将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次。用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30min（回收）。