细胞内钙离子的浓度变化研究

引言

细胞以何种方式对外部环境做出反应？就像人与人通过语言进行交流一样，细胞也通过生理信号与其它细胞进行交流。在我们的体内，与细胞间交流相关的生物促进剂诱发各种生理现象。贯穿细胞膜内外的各种离子是主要的生物促进剂；其中，钙离子是人体内zui常见的信使。钙离子在细胞的新陈代谢中起到zui重要的作用，从肌肉纤维收缩至激素分泌都离不开钙离子。为获得生理作用和生理信号信息，须观察活细胞内离子浓度的变化。目前，通常采用与离子结合时呈现荧光的 FURA-2 或 INDO-1 等螯合荧光探针（图 1）观察活细胞的离子浓度变化。上述荧光检测方法的优点在于不会破坏样品，而且可实时检测。

图1. 钙离子检测的分子结构(FURA-2 (a)，INDO-1 (b))

根据离子浓度，荧光探针试剂的荧光光谱形态会发生变化。追踪离子未结合光谱中zui大波长和离子结合光谱中zui大波长（FURA-2：340/380nm；INDO-1：405/480nm）下的荧光值，可计算浓度变化。不过，人体内的钙离子浓度变化以微秒为单位进行，而通用型荧光分光光度计以秒为单位通过光栅发生波长移动，因此利用现有的方法很难实现检测。为此Thermo Fisher提供了检测单位zui短可达 150微秒的快速滤波附件用于解决该问题（图 2）。快速滤波附件可分别安装4个激发滤光片和发射滤光片，可检测瞬间发生的浓度变化。在本应用中，利用荧光粉分光光度计（Lumina）和快速滤波附件，观察与荧光探针相结合的钙离子的浓度变化趋势。

图 2. 快速滤波附件 (a) 和滤波片转轮 (b)

试剂 

1.荧光分光计 (Lumina)

2.快速滤波配件（FURA-2 用带通滤波片激发：340、380nm；发射：510nm

3.INDO-1 用带通滤波片激发：355nm；发射：405、480nm）

4.100uM FURA-2（DMSO中）

5.100uM INDO-1（DMSO中）

6.1mM CaCl（DW中）

荧光比色皿

实验步骤

1.为确认不同钙离子浓度下的光谱变化，调制含量为0nM、100nM、200nM 的 FURA-2、INDO-1试剂。

2.利用波长扫描模块，按浓度监测 FURA-2 和 INDO-1 试剂的光谱。在此，FURA-2 需激发扫描，INDO-1 需发射扫描。

3.采用快速滤波模块实时检测不同钙离子浓度下的荧光谱图。

4.将填充荧光探针物质的比色皿装于快速滤波附件中。

5.根据检测条件输入设定值后，边更改离子浓度边检测。以每 10 分钟总浓度增加 100nM 的频率，分 2 次注入钙离子。

6.以每 10 分钟总浓度增加 100nM 的频率，分 2 次注入钙离子。

仪器参数

图 3. 波长扫描模式下的检测条件 (FURA-2 (a)，INDO-1 (b))

图 4. 快速滤波模式检测条件

结果

图 6(a)、(b)展示了波长扫描模式下检测到的不同钙离子浓度下FURA-2、INDO-1 光谱。根据检测结果可确认，随着浓度的改变，波长呈现渐进式变化。

总结

在本研究中，利用 Thermo Fisher 开发的荧光分光光度Lumina和快速滤波附件，确认了不同钙离子浓度下离子荧光探针的荧光光谱变化。另外，通过钙离子变化实验，可确认两个固有波长下的荧光强度发生了逆转，据此还可实时监测离子浓度的变化。